SECUENCIACIN MASIVA DE ADN

Next Generation Sequencing (NGS)

Las nuevas tecnologas de secuenciacin (Next
Generation Sequencing-NGS), son una poderosa
herramienta para estudios de genmica estructural y
funcional, siendo capaces de secuenciar organismos
completos en cosa de horas.
Cyclic Reversible Termination (CRT).
Terminacin reversible cclica
METODO
Este mtodo usa terminadores reversibles en un
mtodo cclico que incluye la incorporacin de
nucletidos, la captura de fluorescencia y la ruptura:
La DNA polimerasa unida al tmplate con el primer,
incorpora (por complementariedad de bases)
un solo nucletido marcado con fluorescencia.
Despus de la incorporacin, se lavan los
nucletidos no incorporados y se lee la
fluorescencia (reflexin interna total de
fluorescencia o TIRF) mediante lseres para
determinar la identidad del nucletido
incorporado.
Sigue un paso de ruptura para eliminar el grupo
terminador.
La clave de este mtodo es el terminador
reversible, del cual hay dos tipos: bloqueado o sin
bloquear en el extremo 3'.
Fig. 6a. Terminadores reversibles bloqueados
en el extremo 3'
Fig. 6b. Terminadores reversibles sin bloquear
en el extremo 3'
La deteccin puede ser mediante un solo color
(todos los nucletidos marcados con el mismo
fluorforo) o mediante 4 colores (cada nucletido
marcado con un fluorforo diferente) tal y como se
muestra a continuacin:
Fig. 7a. Mtodo CRT de 4 colores.
Fig. 7b. Mtodo CRT de un solo color.
La secuenciacin Ion Torrent
La secuenciacin por Ion Torrent es un mtodo de secuenciacin
de ADN basado en la deteccin de protones liberados durante
la polimerizacin del ADN. Por lo tanto, este mtodo se gua a travs de
las polimerizaciones que se llevan a cabo en las cadenas simples de ADN
en estudio.
Este tipo de secuenciacin difiere de los dems tipos en que no usan
nucletidos modificados y que la deteccin no se realiza va ptica, sino
por deteccin de pH.
Todo empez hace unos 36 aos, cuando el bioqumico ingls Frederick
Sanger desarroll la primera tcnica de secuenciamiento de ADN. El
procedimiento al cual posteriormente llamaron Mtodo de Sanger era
sumamente complejo, ya que requera del uso de nucletidos marcados
con fsforo radiactivo (P-32), nucletidos desoxigenados (ddNTPs),
cuatro reacciones en paralelo y un gel de electroforesis muy largo.
Con los secuenciadores basados en el mtodo de Sanger se secuenci el
genoma humano por el ao 2003, el cual cost unos $3,000 millones.
Luego vinieron los primeros secuenciadores por
sntesis, los cuales se basan en la lectura de la
secuencia de ADN a partir de la sntesis de la
hebra complementaria gracias a la accin de una
ADN polimerasa. Entre ellas tenemos
los pirosecuenciadores, los cuales se basan en la
deteccin de luminiscencia emitida durante la
reaccin de sntesis del ADN y la tecnologa SOLiD,
que se basa tambin en la deteccin de
fluorescencia emitida durante una reaccin
de ligacin de ADN.
Ion Torrent Secuenciacin por semiconductores
Personal Genome Machine (PGM)
pH V
El equipo secuenci los genomas completos de cinco secuencias anotada en el
GenBank:
3 E. Coli
V. Fischeri
R. Palustris
Tambin se demostr su utilidad al secuenciar el genoma:
E. Coli O104:H4
2 horas
Chip $99
Ion Personal Genome Machine (PGM) -$50,000
Caus brote
infeccioso en
Alemania
1000 casos
50 muertes
REFERENCIA
http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicaci
on_Secuenciacion_Masiva&opc=tecnicas&idap=79
#3
http://www.lifetechnologies.com/mx/es/home/life-
science/sequencing/next-generation-
sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-
technology.html