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TÉCNICAS DE
SECUENCIACIÓN
DEL ADN

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INTRODUCCIÓN
La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya
finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T), así como la
orientación en una molécula de ADN. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha
acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las
metodologías actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha
sido de gran importancia para proyectos iniciales multinacionales de secuenciación a gran
escala como el secuenciamiento del genoma humano. En la actualidad se conoce la
secuencia del genoma de múltiples especies de animales, plantas y microorganismos;
muchos de ellos se encuentran disponibles libremente en la web. Por ejemplo, más de
200,000 genomas secuenciados se encuentran almacenados en la base de datos NCBI.
Sin embargo, ninguna de las metodologías existentes es perfecta, por lo que en algunos
casos se pueden generar errores y se deben usar estrategias para lidiar con ellas.
A partir del descubrimiento de las estructuras de la molécula de ADN (Watson y Crick
1953), hace poco más de 50 años, se han producido millones de secuencias de especies
de arqueas, bacterias y eucariontes. En los inicios de la secuenciación, obtener la
secuencia de un fragmento de 5 o 10 nucleótidos resultaba un proceso muy costoso y
complicado. Sin embargo, los avances científicos y tecnológicos han permitido tener hoy
en día una gran cantidad de secuencias de ADN con información de importancia médica,
ecológica, fisiológica y evolutiva. En 1976, Walter Fiers y colaboradores, secuenciaron el
genoma completo del bacteriófago Ms2 de aproximadamente unas 3 500 pares de bases
(pb). Pero es en 1977 cuando surgen dos técnicas modernas de secuenciación de ADN: la
secuenciación química de Maxam y Gilbert (1977) (Figura 2) y el método que revolucionó
a la biología molecular, la secuenciación enzimática de Sanger (Sanger et al. 1977a). La
técnica enzimática se basa en la interrupción controlada de la replicación del ADN in vitro.
Se realiza una PCR del fragmento que se va a secuenciar pero, a diferencia de una PCR
convencional (ver capítulo de PCR), se utiliza un solo iniciador y se agregan
dideoxinucleótidos (ddNTPs) que carecen del grupo hidroxilo en el extremo 3´ y están
marcados con radiactividad o con fluoróforos.

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Figura 2. Secuenciación química de Maxam-Gilbert. El fragmento de ADN que se desea

secuenciar se desnaturaliza (1), se marca el extremo 5’ con radiactividad (2), la muestra
se divide en cuatro alícuotas que son tratadas con diferentes reactivos químicos que
cortan al ADN en bases específicas (A, T, C, G) (3), en cada alícuota, queda una colección
de fragmentos de ADN de diferente tamaño que termina en una base específica. Los
fragmentos se separan electroforéticamente en un gel de poliacrilamida (4) y se
visualizan y analizan por medio de una radiografía (5).

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Figura 4. Fragmentos de ADN obtenidos después de la PCR de secuenciación, son de

diferentes tamaños y cada una termina en una de las bases marcadas con un fluoróforo
distinto.

Figura 5. Secuenciación automática de ADN. Se realiza una electroforesis del producto

de PCR de secuenciación (Figura 4), los fragmentos migran de acuerdo a su tamaño (los
pequeños migran más rápido), el fluoróforo con el que van marcados es detectado por
un láser, éste envía una señal que es interpretada por el equipo en forma de un pico en
un electroferograma.
11 genes. Desde entonces, este método ha sido utilizado ampliamente en muchas
líneas de investigación, generando tal cantidad de secuencias que a principios de los
ochenta fue necesario crear bases de datos universales para resguardar la información y
hacerla accesible a los usuarios. En 1982, año en que se crea el Gen Bank a través del
National Center for Biotechnology Information (NCBI), existían más de 2 000 secuencias
y para principios del 2011 esta base de datos estaba integrada por más de 100 000 000
secuencias. En cuanto a genomas completos, en total se tienen registrados y en proceso
de ser secuenciados cerca de 6 000 distintos, siendo los virus los que mayor número de
variantes secuenciadas presenta (NCBI 2011). Se cuenta con las siguientes secuencias: 1
548 bacterias, 83 arqueas, 281 ecuariantes y 281 genomas. En 1995, año que
representa un parteaguas en las ciencias genómicas, se secuencia el primer genoma
completo de un organismo, de la bacteria oportunista Haemophilus influenzae, que
causa múltiples infecciones en humano como meningitis, otitis, conjuntivitis y sinusitis
(Fleischmann et al. 1995). El genoma de esta especie es de alrededor de 1, 800, 000 pb
con más de 100 genes asociados con el proceso de infección (Fleischmann et al. 1995).
A partir de ese año se comenzó la secuenciación de genomas, principalmente de
microorganismos de importancia médica.

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EL MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER CLÁSICO

El principio clave del método de Sanger es el uso de
didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como
terminadores de la cadena de ADN. La muestra de ADN se
divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas
que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar
(dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y una ADN polimerasa (Sanger
et al., 1977a). En cada reacción se añade solo uno de los
cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o
ddTTP). Estos didesoxinucleótidos terminan la elongación
de la cadena al carecer de un grupo 3'-OH que se necesita
para la formación del enlace fosfodiéster entre dos
nucleótidos durante la elongación de la cadena de ADN. La
incorporación de un didesoxinucleótido en la cadena
naciente de ADN termina su extensión, lo que produce
varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los
didesoxinucleótidos se añaden a concentraciones lo
suficientemente bajas como para que produzcan todas las
posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean
suficientes para realizar la secuenciación. Esta técnica fue
empleada para secuenciar el bacteriófago ϕX174 usando
geles de acrilamida de 1 a 2 mm para separar los
fragmentos obtenidos de la amplificación con
desoxinucleotidos (Sanger et al., 1977b). Ver descripción
gráfica del método en Anexos.
Figura 1.- Se muestran los cuatro carriles del gel de
poliacrilamida con cada una de las reacciones de
secuenciación. Interpretación: La secuencia se lee de abajo hacia arriba. Una banda
intensa en la primera columna y una banda tenue en la segunda corresponden a una
Adenina, mientras que la situación inversa corresponde a una Guanina en esa posición.
Una banda que aparece en la tercera y cuarta columna en la misma posición indica una
C. y una banda sólo presente en la ultima columna corresponde a una T.

EL MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER

AUTOMATIZADO
El método de secuenciación tradicional de Sanger era muy laborioso y costoso. La
automatización era el paso siguiente evidente en el desarrollo de los métodos de
secuenciamiento. En 1986, Applied Biosystems Incorporated (API) - hoy Applied

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Biosystems (ABI) - anunciaron el primer secuenciador automatizado de ADN inventado

por L. Hood y su equipo de trabajo en el Instituto de Tecnología de California (Caltech), y
cuya principal innovación consistió en la secuenciación con terminadores fluorescentes
como variante del método de Sanger (Smith et al., 1986). Ésta es la principal razón de que
se siga utilizando este método hasta el día de hoy. Las mejoras introducidas fueron las
siguientes:
1.- Los ddNTP terminadores de cadena están marcados fluorescentemente. Cada ddNTP
se marca con un fluoróforo distinto, que no interfiere en la reacción de la polimerasa y
que emite luz con una longitud de onda característica. De este modo, la reacción se lleva
a cabo en un sólo tubo, no en cuatro.
2.- Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible
automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada ciclo aumenta de forma
exponencial el número de fragmentos generados, cada uno marcado con una molécula
fluorescente que emite luz de distinto color, en función del ddNTP terminal. Por eso, a
este método también se le conoce como secuenciación cíclica.
3.- La separación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es más
rápida que la electroforesis en gel. Los fragmentos de distintos tamaños llegan al final del
capilar, donde son excitados con un láser y se detecta la fluorescencia emitida por el
ddNTP terminal. El color de esta fluorescencia determina de qué nucleótido se trata. El
gráfico resultante se denomina electroferograma, en el que se observan picos de diversos
colores. Cada color indica qué nucleótido ocupa cada posición en la molécula de ADN o,
lo que es lo mismo, su secuencia.

SISTEMAS DE SECUENCIACIÓN DE ADN DE NUEVA

GENERACIÓN - NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)
Las plataformas NGS, son también conocidas como plataformas de secuenciación masiva
o métodos de secuenciamiento de alto rendimiento (high throughput sequencing
methods), y en los últimos años han permitido el secuenciamiento masivo de ADN,
reduciendo el costo cientos de veces y democratizando este campo. La elevada demanda
de secuenciación de éstos métodos de bajo costo ha llevado a la innovación y rápido
desarrollo de los métodos NGS, ya que pueden producir miles o millones de secuencias a
la vez en paralelo. Éstas nuevas tecnologías al evolucionar rápidamente, tienen el
potencial de acelerar la investigación biológica y biomédica, permitiendo el análisis
comprensivo de genomas, transcriptomas e interactomas, y a su vez haciéndolos menos
costosos, rutinarios y ampliamente usados (Shendure & Ji, 2008).

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COMPONENTES DE LAS PLATAFORMAS DE SECUENCIACION

MASIVA – NGS
Las técnicas que se benefician de la secuenciación masiva deben abordar necesariamente
dos fases: la fase in vitro y la fase in silico (Fig. 2). La primera fase (in vitro) consiste en la
construcción de bibliotecas genómicas de acuerdo a la técnica ensayada, seguida de la
subsiguiente secuenciación de dichas bibliotecas en una plataforma de secuenciación. La
metodología para construir las bibliotecas es específica de cada técnica. La segunda fase
(in silico) comprende el análisis bioinformático de los ficheros de lecturas generados por
las distintas plataformas de secuenciación masiva.

PRIMERA GENERACIÓN: PIROSECUENCIACIÓN

La Pirosecuenciación es una técnica enzimática de secuenciamiento de ADN que se basa
en la detección de una molécula pirofosfato (PPi) liberada durante la síntesis de ADN. En
una cascada de reacciones enzimáticas, la luz generada es proporcional al número de
dNTPs incorporados. Esta cascada inicia con una reacción de polimerización de ADN en
el que una molécula inorgánica de PPi es liberada como resultado de la incorporación de
los dNTPs incorporados por una polimerasa. La molécula libre de PPi es luego convertida

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a ATP por una enzima ATP-sulfurilasa que provee la energía a la enzima luciferasa para
oxidar a la luciferina y generar luz. Debido a que se conoce el dNTP añadido, se puede
conocer la secuencia de los nucleótidos de la cadena inicial de ADN. Finalmente
interviene la enzima apirasa, que degrada los dNTPs que no se han unido en la reacción
previa con el fin de que al añadir un nuevo dNTP, no existan restos de reacciones
anteriores (Ronaghi, 2001).

SECUENCIADORES 454 (ROCHE)

La compañía 454 Life Sciences (ahora Roche Diagnostics) desarrolló una versión de
Pirosecuenciación en paralelo automatizado (Pirosecuenciamiento) en el que se amplifica
el ADN dentro de gotas de agua en una solución de aceite, conocida también como
emulsión de PCR (Margulies et al 2005). La muestra de ADN se carga en una placa
especial, que permite transmitir la luz producida por quimioluminiscencia durante la
reacción de secuenciación hasta la cámara CCD de captación de imágenes. Dicha placa,
en forma de panal, posee multitud de pocillos. La particularidad es el tamaño del DNA a
secuenciar en cada pocillo: debe ser entre a 500 y 1000 nucleótidos. La genoteca de DNA
genómico con la cual comenzar la secuenciación se carga en la placa; en ella, cada
fragmento se amplifica de forma aislada mediante em-PCR (PCR en emulsión), de modo
que se amplifique hasta 10 millones de veces; este incremento facilita la detección de la
señal. El fundamento de la secuenciación se basa en controlar el flujo secuencial y cíclico
de nucleótidos sobre la placa en combinación con un sistema de detección
bioluminiscente que permite convertir los productos generados durante la incorporación
de nucleótidos (pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el
dispositivo CCD (Metzker, 2009).

SECUENCIADORES SOLID
Los secuenciadores SOLID (Support Oligonucleotide Ligation Detection) de Applied
Byosistem (ahora Termofisher), utilizan técnicas enzimática de ligación y de emulsión de
PCR. Permite el empleo de distintos tipos de muestras ya sean fragmentos sueltos o
grupos de dos fragmentos unidos mediante un cebador. El proceso de amplificación es
similar al de 454 a excepción del anclaje final de las nanosesferas a una superficie de
cristal donde se da la secuenciación. El proceso de secuenciación ocurre luego de
distintas rondas de hibridación y ligado con 16 dinucleótidos marcados con 4 colores
distintos. Empleando un código de colores, cada posición es evaluada dos veces lo que
aumenta drásticamente la discriminación entre errores de secuencia y polimorfismos de
SNPs. Alineados éstos sobre una secuencia de referencia, se obtiene la secuencia de
nucleótidos. Lamentablemente por su alta tasa de error y la generación de secuencias
muy cortas, de unas 50 pb, provocó que, con el paso de los años, como en el caso de 454,
sea una de las estrategias menos utilizadas (Mardis, 2008).

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II GENERACIÓN: PCR EN PUENTE - SECUENCIADORES

ILLUMINA (EX-SOLEXA)
En esta tecnología se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas
fluorescentes al igual que en la Secuenciación de Sanger. Además de la paralelización
masiva (es decir la capacidad de realizar millones de secuencias en cada corrida), la
diferencia con el método convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia una
vez obtenida la imagen, y desbloquear carbono 3’ de modo que pueda aceptar una nueva
base para continuar la reacción de secuenciación, haciendo que la incorporación de un
nucleótido terminador sea reversible. Otra vez los cuatro nucleótidos terminadores
marcados son ofrecidos a los clústers, comenzando un nuevo ciclo (Morozova et al.
2009). Esta metodología también se la conoce como Secuenciación por síntesis y la
compañía Illumina es la que lidera a nivel mundial, permitiendo abaratar costos y ofrecer
lecturas más largas, sin embargo, se requiere de una gran inversión inicial y de
mantenimiento, para poder adquirir y mantener uno de los equipos que ofrece.

VENAJAS Y DESVENTAJAS
Una de las grandes ventajas al trabajar con secuencias es que el ADN se encuentra en
todas las células de los organismos y se puede recuperar de tejido vivo o muerto. La
mayoría de tejidos o fuentes de los que es posible extraer ADN se colectan fácilmente en
el campo y en muchas ocasiones es suficiente menos de un gramo para extraerlo (véase
capítulo de extracción de ADN).
La 246 Herramientas moleculares aplicadas en ecología molécula de ADN es tan estable
que puede permanecer intacta por cientos de años (Cano et al. 1993).
Otra ventaja es que las diferentes regiones del genoma experimentan diferentes tasas de
evolución. Por ejemplo, las regiones que codifican para genes están sujetas a selección
natural, la cual previene la acumulación de mutaciones, en cambio, las regiones no
codificantes son más variables porque pueden acumular cambios mutacionales de
manera neutral (Parker et al. 1998).
Esta tasa evolutiva diferencial permite realizar estudios a amplias escalas como la
evolución del virus VIH en un solo paciente a lo largo de un mes o el árbol de la vida en la
Tierra con seleccionar el fragmento adecuado para nuestro estudio (Page y Holmes
1998). También, se puede trabajar con secuencias de regiones mitocondriales o de
cloroplasto que generalmente son heredadas de manera uniparental para desarrollar
estudios de efecto fundador, hibridación y relaciones matrilineales (Lewin 2001).
La principal desventaja de esta técnica es el costo. Sin embargo, los avances tecnológicos
la hacen cada vez más barata, por ejemplo los secuenciadores son cada vez más precisos
y solo requieren de cantidades mínimas de reactivos para obtener un buen resultado.

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PERSPECTIVAS
La técnica de secuenciación de Sanger se continúa utilizando en un gran número de
laboratorios e incluso se siguen produciendo equipos con gran capacidad de análisis de
muestras, hoy en día es posible procesar 96 muestras en menos de una hora y media lo
que hace más eficiente la obtención del resultado. Sin embargo, en los últimos años han
surgido nuevos métodos que superan al método dideoxi. Estos métodos son
“masivamente paralelos” y el número de secuencias que leen en un solo experimento es
muy superior al logrado por la electroforesis capilar desarrollada en este capítulo. Estos
métodos junto con los nuevos equipos de secuenciación hacen que un solo investigador
en una sola corrida, obtenga lo que hace una década se lograba en varios años y con la
colaboración de varios laboratorios (Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008).
La secuenciación es una de las técnicas moleculares que más ha crecido en los últimos
años, por lo cual las perspectivas son muy amplias. En los últimos años, las plataformas
de secuenciación de ADN de forma masiva en paralelo (Ronaghi et al.1998, Ronaghi 2000)
están disponibles en laboratorios de varios Secuenciación de fragmentos de ADN 247 rios
países (incluido México) reduciendo el costo de la secuenciación del ADN en más de dos
órdenes de magnitud. La gran cantidad de información que se genera impone retos al
desarrollo de protocolos robustos para la generación de bibliotecas de secuenciación, la
creación de nuevos enfoques y métodos de análisis de datos, y un replanteamiento del
diseño experimental. La próxima generación de la secuenciación del ADN permite el
análisis exhaustivo de genomas, transcriptomas e interactomas que tiene el potencial de
acelerar la investigación biológica y biomédica (Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008).
Se espera el surgimiento de nuevas líneas de investigación, así como surgieron hace
algunos años, la filogenómica que tiene como objetivo generar propuestas filogenéticas
con multigenes para explicar de una manera robusta la historia evolutiva y las relaciones
entre grupos; o la metagenómica que busca secuenciar ADN del ambiente y con ello
caracterizar a las especies que componen una comunidad y descubrir los genes de estas
especies aun en organismos de difícil aislamiento y cultivo, como bacterias, arqueas,
hongos, protozoarios (Vogel y Nalin 2003, Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008).

WEBGRAFÍA
http://www.encuentros.uma.es/assets/journals/13/173singles/173.7_secuenciacion.p
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/SeminariodeTesisI-PercyRojas.pdf
WIKIPEDIA
López De Heredia Larrea, Unai (2016). Las técnicas de secuenciación masiva en el estudio de la
diversidad biológica. Munibe Ciencias Naturales.

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