Extracción de ADN

TATA

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Presentación del seminario

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Extracción de ADN

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DEFINICIÓN DE LA TÉCNICA:

La extracción del ADN consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de

ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula.

Actualmente existen dos métodos para la extracción del ADN que son los métodos
tradicionales y los kits de extracción que son los métodos modernos de los cuales
hablaremos a continuación.

PARA QUE SE UTILIZA

La extracción del ADN íntegro y sin contaminantes es el primer paso en la lista de

varias técnicas moleculares que permiten comprender mejor y conservar la
diversidad biológica a partir del conocimiento de los genes y del genoma.

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PASOS DE LA EXTRACCIÓN DEL ADN:

1. Colecta de la muestra

Tejido: Cortar el tejido en pedazos pequeños para facilitar su posterior

maceración. El tejido se puede deshidratar con etanol al 70 % (aunque esta
opción puede degradar el ADN o acarrear contaminantes) o bien, congelarse
con nitrógeno líquido. Para transportar la muestra es recomendable utilizar un
buffer especializado que inactive las endonucleasas. Otra opción es
homogeneizar el tejido en buffer de lisis que contenga sales de guanidina o
ß-mercaptoetanol que inhiben DNasas y RNasas.
 Sangre: Utilizar agujas de calibre apropiado, respetar la relación muestra/
anticoagulante y homogeneizar correctamente la muestra para evitar la
hemólisis y/o coagulación, y la contaminación bacteriana.

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2. Homogeneización del tejido

La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones

entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que
ayudan a liberar el material genético.

La homogeneización mecánica:

● Nitrógeno líquido: este procedimiento consiste en macerar la muestra con

nitrógeno líquido, en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo muy
fino. El nitrógeno líquido, congela de inmediato la muestra y evita que se
formen cristales en el interior de la célula que rompen la estructura celular e
inicie el proceso de degradación.

La Homogeneización química:

● En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene

en solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y
agentes caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso
pueden perforar la membrana celular.

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3. Lisis celular:

Durante el proceso de lisis se produce una destrucción de las interacciones entre los
componentes celulares (moléculas que conforman la pared, la membrana celular y
nuclear) permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones
básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana
celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN.
Muchas soluciones de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con los
iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNasas. Los componentes
celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que permanecen en
solución se separan del ADN por centrifugación.

Tanto la homogeneización como la lisis celular son similares en los protocolos

tradicionales y comerciales.

LAU RAMIREZ

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1. PROTOCOLO TRADICIONAL

Separación de proteínas y lípidos

En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes

orgánicos como el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamilico, al igual que por ciclos
de centrifugación. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que
permite aislar al ADN.

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Precipitación del ADN

Consiste en recuperar el ADN y para eso se adiciona etanol y soluciones con altas
concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta
mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se
pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que
el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los
restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se
elimina por evaporación.

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Redisolución del ADN

Este proceso tiene la finalidad de hidratar el ADN para mantenerlo en solución. En el

caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolución completa
del ADN y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se utiliza una solución amortiguadora,
es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0
para almacenar el material.

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2. PROTOCOLO COMERCIAL

unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado

● Kit de membranas de sílice:

Antes de pasar la solución de lisis a través de la columna, se adiciona etanol a la

solución, eliminando la capa hidratante del ADN y exponiendo sus grupos fosfato,
facilitando con ella la adsorción de la molécula a la membrana cargada
positivamente. Los lípidos y proteínas como no son afines a la membrana se
eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de centrifugación, mientras
que el material genético permanece unido a la matriz.

LUIS FELIPE
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● kit con perlas magnéticas

Se utiliza pH específicos, un imán o magneto que atrae a las perlas para separarlas
de las soluciones en las que se encuentran suspendidas. Después, se añade a la
solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que permite cargar
positivamente a las perlas, favoreciendo la unión de ADN. Las proteínas y lípidos
son eliminados con soluciones de lavado a pH fisiológico.

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Recuperación del ADN de la matriz

La membrana y el ADN se deshidratan con soluciones de lavado y ciclos de

centrifugación, después se recomienda centrifugar nuevamente la columna para
evaporar el etanol y eliminar el exceso de las soluciones. Posteriormente, se
adiciona agua o solución amortiguadora al centro de la membrana, se espera a que
el ADN se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz y resuspenderlo.

En el protocolo de perlas magnéticas se utiliza una solución básica de Tris-HCl 10

mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas. El ADN se separa de las perlas
y transfiere a otro tubo, mientras que las perlas continúan siendo retenidas por el
magneto.

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Metodo de analisis para ambos procesos

Cuantificación del ADN

La ley de Beer-Lambert va a indicar la concentración de una molécula en solución

dependiendo de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas. Una
característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite
estimar su concentración mediante espectrofotometría.

- Para estimar la pureza del ADN se considera la relación de absorbancia de

260 nm y 280 nm.
➔ > o = a 1.8 es ADN puro, pero < a 1.8 indican la presencia de
proteínas.
➔ Relacion de 260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango
de 2.0 a 2.2, si es menor indican la presencia de carbohidratos o fenol.

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Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis

Si el ADN está íntegro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en
que se colocó la mezcla de ADN. Si está fragmentado, se observará una banda de
más de un cm de ancho o un sendero luminoso en el carril de la muestra.

Almacenamiento del ADN

La muestra de ADN puede ser almacenado a 4 °C para los análisis inmediatos y el

material restante a -20 °C o -80 °C, para una preservación por varios meses.

LAU JORDAN

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PCR
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DEFINICIÓN DE LA TÉCNICA:

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite amplificar de forma

exponencial un fragmento de ADN específico. Su función es sintetizar muchas
veces un fragmento de ADN utilizando una enzima polimerasa que trabaja a
temperaturas muy elevadas (de la bacteria Thermus aquaticus) y se conoce como
Taq polimerasa.

PARA QUE SE UTILIZA:

La PCR es una técnica utilizada para:

● La amplificación de unas secuencias repetitivas (microsatélites) que se utiliza

para determinar grados de parentesco e identificar individuos concretos.
● Es una herramienta de diagnóstico epidemiológico (bacterias, virus,
parásitos) y medicina (cáncer, enfermedades hereditarias).
● En biología molecular, permite realizar mutagénesis dirigida mediante la
introducción de cambios en los cebadores.

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COMO SE HACE:

Para realizar la PCR se necesita:

● Taq polimerasa (mag-taq polimerasa).

● Dinucleótidos.
● ADN.
 ● Agua.
● Buffer con magnesio y otras sales.
● Oligonucleótidos.

La reacción de PCR es muy sensible a cambios de iones, temperaturas o

contaminantes que pueden estar en el ADN o en el agua y también pueden haber
variaciones de un termociclador a otro.

La sensibilidad de esta prueba puede verse afectada por la contaminación con un

ADN exógeno o por mayor o menor concentración de los reactivos, como por
ejemplo cuando los oligonucleótidos están degradados, defectuosos, mal diseñados
o que la cantidad utilizada no sea la correcta afectando el rendimiento de la PCR
impidiendo la amplificación del fragmento de ADN.

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Para realizar esta técnica se requieren termocicladores, que aumentan o disminuyen

la temperatura de un bloque que invierte la corriente eléctrica. Normalmente los
termocicladores calientan o enfrían los tubos a tres temperaturas diferentes que se
repiten una y otra vez (ciclos de reacción).

● Primera temperatura: Es a 95ºC, se realiza con el fin de desnaturalizar la

doble cadena del ADN, quedando en forma de cadenas sencillas. La fase
inicial (desnaturalización inicial) va a tener un tiempo de duración de 5 - 10
min. Posterior a esto, los demás ciclos pueden durar 30 segundos.

● Segunda temperatura: Se da en un intervalo entre 40º y 60ºC

(alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente
los puentes de H+ entre los oligonucleótidos y el ADN, las uniones más
estables (las que son complementarias) durarán mayor tiempo, quedando los
oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña región de doble cadena.
El tiempo que debe durar cada ciclo en esta temperatura, es de 30 segundos.

Los cebadores deben tener un tamaño de 20-30 nucleótidos, temperaturas de

alineamiento similares y no ser complementarios entre sí debido a que se
podrían formar dímeros.

PIPE MENA

● Tercera temperatura: Esta se aumenta a 72ºC (paso que se conoce como

extensión), debido a que es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza
su máxima actividad y se une a la pequeña región de ADN de cadena doble
formado por los oligonucleótidos y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al
agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las
 bases estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio
para el siguiente paso. El tiempo en esta temperatura es variable, pero se
recomienda que para el último ciclo, se deja por 10 minutos, con el fin de
asegurar que los fragmentos incompletos se terminen de sintetizar.

En cuanto al tiempo, existe una regla que puede aplicarse a casi todos los PCRs: la
temperatura de desnaturalización y de alineamiento es suficiente de 30 a 60
segundos. Casi todos los PCRs funcionan bien con 30 ciclos, aunque pueden
usarse desde 20 ciclos hasta 35.

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Ciclos de reacción:

1. Primer ciclo: Con estas tres temperaturas, se sintetizan los primeros

fragmentos a partir del ADN genómico. Estos no tendrán el tamaño esperado
y serán un poco más grandes ya que la taq copiará hasta donde le sea
posible.

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2. Segundo ciclo: Se repite nuevamente las tres temperaturas, pero aquí los
oligonucleótidos, además de unirse al ADN inicial también se unirán a los
fragmentos recién sintetizados del primer ciclo, por lo tanto la polimerasa
sintetiza ahora 2 fragmentos largos copiados directamente del ADN y 2
fragmentos del tamaño esperado, que es el tamaño que hay entre los dos
oligonucleótidos que hemos usado.

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3. Siguiente ciclos en adelante: De esta forma con cada ciclo aumentará el

número de fragmentos del tamaño que se requiere.

Para este tipo de PCR es necesario que uno de los oligonucleótidos tenga la
misma secuencia que se encuentra en una de las cadenas del ADN y el otro
deberá llevar la secuencia complementaria que estará al final del fragmento
que se quiere amplificar (se les llama forward y reverse) para que uno sea
complementario a la cadena que forma el otro; si no es así no podría
amplificarse el sitio que se necesita.

Como cada fragmento sintetizado sirve de base para sintetizar otros en el

siguiente ciclo, el número de copias aumentará en forma exponencial. Al
 finalizar el ciclo número 35 de PCR se producirán millones de nuevos
fragmentos.

Al final el termociclador tendrá una temperatura de 4º C para que conserve

los tubos para posteriormente verificar si han sido amplificados
correctamente.

LAU OLIVA

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TIPOS DE TÉCNICA:

1. PCR para la amplificación de un solo sitio conocido del genoma

(locus=lugar específico del cromosoma donde está localizado un gen u otra
secuencia de ADN). Estos PCRs requieren conocer la secuencia que se
trabaja, por ejemplo cuando amplificamos un gen específico.
2. PCR para la amplificación de regiones no conocidas, las cuales son
zonas hipervariables del genoma, por lo cual no se sabe el tamaño del
fragmento (o fragmentos) que se esperan.

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VISUALIZACIÓN DE PCR:

Electroforesis:

Para poder analizar los fragmentos obtenidos en el PCR se utiliza la electroforesis

mediante geles de agarosa o de acrilamida, los cuales permiten separarlos de
acuerdo al tamaño de cada uno; esto sucede debido a que estas geles forman una
especie de red con agujeros de distintos tamaños por donde están obligados a
pasar los fragmentos de ADN, “atrayendolos” a través de corriente eléctrica, hacia el
polo positivo, ya que la carga de una molécula de ADN es negativa por la
presencia de grupos fosfato (P-).

Si hay muchos fragmentos de un mismo tamaño se agruparán todos juntos, por lo

que podrá observar una banda en el gel.

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Técnica de hibridación de Southern

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El Southern Blot es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de
ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de
nitrocelulosa o nylon. Permite la detección simultánea de varias secuencias de
distintos tamaños con una única hibridación. Típicamente se utilizan sondas
radiactivas.
analizar regiones polimórficas del ADN.

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Procedimiento: Para la realización de la técnica de hibridación de southern se

realizan 6 pasos.
● El primero es la extracción del ADN el cual ya se explicó anteriormente
● El segundo es la digestión de ADN con una endonucleasa de restricción
en donde El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de
restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga
una secuencia característica.

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El tercer paso es la electroforesis en gel de agarosa que como se mencionó

anteriormente consiste en la separación de los fragmentos de ADN resultantes.

Las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo
positivo. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del
gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua
de los fragmentos de ADN.

KAROLD G

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El cuarto paso es la preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

En donde las moléculas de ADN separadas en la electroforesis se desnaturalizan
mientras permanecen en el gel de agarosa, el cual es impregnado con una
disolución alcalina. Tras su neutralización, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o
"calco" conservando la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida
en el gel como resultado de la electroforesis.

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El quinto paso es la Hibridación con sonda radiactiva en donde con una sonda
de locus único (molécula pequeña de ADN o ARN) la cual es capaz de hibridar con
el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La
formación de la molécula bicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de
bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente. El
Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una
sonda radioactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración
de sales que favorezcan la hibridación. Las sondas de locus único se marcan con un
isótopo radiactivo facilitando su detección. Tras producirse ésta, se lava el exceso
de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana
de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

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El último es la detección de los RFLPs mediante autorradiografía (autorad) que

son las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del
ensayo de Southern. En esta técnica, la membrana de nylon se coloca una vez
lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísla de la luz. La
película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva.

Diapositiva 31 y 32

Referencias bibliográficas

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Gracias