Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos

Estudiante:

Biotecnología

Docente
Ana María García Cepero

Programa de Química Farmacéutica

Facultad de Ciencia Farmacéuticas y Alimentarias
Universidad de Antioquia
Semestre 2022-2
Medellín
Introducción
La hibridación de ácidos nucleicos es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios
a partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases, esta unión puede ser
de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN. Para esto se han
desarrollado diferentes técnicas las cuales permiten por medio de hibridación y el uso de
sondas, marcar genes específicos y estudiar diferentes aspectos con mayor facilidad y
detalles, sus aplicaciones han ido desde el diagnostico de enfermedades hereditarias hasta la
medicina forense.

Las sondas de hibridación

Las sondas son segmentos de DNA o RNA de cadena sencilla marcados con moléculas de
fácil detección, como enzimas o radioisótopos. La secuencia nucleotídica de la sonda es lo
que le permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte del genoma, identificar un solo
gen o el fragmento de este, gran parte del éxito de este tipo de estrategias moleculares
depende de la especificidad de la sonda. La longitud de las sondas puede ir desde pequeños
oligosacáridos hasta miles de pares de bases y se pueden obtener por síntesis quimica o por
la utilización de plásmidos. Existen diferentes formas de generar sondas:

 Random Primer Extension Labeling

La técnica fue creada por Feinberg y Vogelstein, quienes usaron una mezcla de
hexanucleótidos para cebar la síntesis de ADN al azar en ADN monocatenario, la técnica se
realiza con la fracción Klenow de la ADN polimerasa I, ya que esta no presenta actividad
exonucleasa 5’ a 3’, lo que evita la perdida de la etiqueta incorporada (radioisopos o enzimas),
también se requiere un cebador y una cadena molde monocatenaria para que la polimerasa
pueda realizar su acción.

 Nick Translation
En 1977 que Rigby y Paul Berg inventaron la “translación de la mella” (Nick translation) como
un método de marcaje radioactivo de ADN con una alta actividad específica in vitro. Sin
embargo, años después la “traslación de la mella” fue desplazada por técnicas que usaban
una enzima de restricción. En este método se combinan dos actividades enzimáticas:

 Actividad DNasa I: suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la

sonda.
 Actividad de DNA polimerasa: a partir del hueco dejado en la cadena anterior enzima,
va incorporando nuevos nucleótidos por complementariedad, tomando como molde la
otra cadena de DNA intacta, entre los nucleótidos incorporados se encuentran lo que
están marcados.

 3’ End Labeling
Las técnicas para el marcado final de oligonucleótidos con radioisótopos han impulsado la
tecnología de marcaje. Estas sondas de oligonucleótidos se pueden personalizar en función
de la información de secuencia del ADN o ARN objetivo en varias horas utilizando un
sintetizador de ADN. El uso de un sintetizador elimina los pasos habituales engorrosos y
lentos involucrados en la clonación y el aislamiento de los fragmentos para ser utilizados como
sondas, las sondas personalizadas son altamente específicas y se pueden diseñar para
detectar cambios de una sola base en un gen. Los oligonucleótidos sintéticos preparados con
grupos hidroxilo 5' y 3' libres no requerirán pretratamiento con fosfatasa alcalina, lo cual lo
hace más rápido y simple.

La desoxinucleotidil transferasa terminal cataliza la adición de desoxinucleótidos 5' trifosfatos

a el extremo 3' de los ácidos nucleicos en una reacción independiente del molde y produce
una cola homopolimérica, esto se puede controlar de diferentes formas:
  Si se utilizan análogos de nucleótidos que carecen de un hidroxilo 3' (NEG026), el
resultado es que un solo nucleótido se añade al extremo 3' del ácido nucleico.
 Usando desoxinucleótidos 2' da como resultado un cola polimérica. El grado de
elongación de la cola 3' se puede controlar manteniendo un exceso molar bajo.

 5’ End Labeling
Para esta técnica se utilizan los mismo oligonucleótidos personalizados por el sintetizador de
ADN mencionados anteriormente, pero se usará la enzima polinucleótido quinasa, identificada
simultáneamente por Richardson, Novagrodsky y Hurwitz en E. coli infectada con Tphage,
dicha enzima cataliza la transferencia del fosfato gamma de ATP al hidroxilo 5' terminal de
moléculas de ADN o de oligonucleótidos, este fosfato a de ser radiactivo para obtener el
marcaje esperado. La fosforilación completa de los 5' hidroxilos se logra utilizando bajas
concentraciones de ATP.

 Reverse transcriptase reaction

Para obtener una sonda por este método lo primero que tenemos que hacer es conocer la
secuencia de bases del ARNm con el que queremos hibridarla (se puede obtener por bases
de datos, solicitar la síntesis a empresas especializadas u obtenerlas en el laboratorio), luego
se debe clonar la secuencia de bases del ARN mensajero que queremos detectar. Para esto
se debe; 1) retrotranscibir los mARN, haciendo copias complementarias de ADN (cADN) de
todos los fragmentos de ARN mensajero. 2) aplicar una PCR para conseguir multitud de
copias de manera específica de la secuencia. 3) introducir las copias en un plásmido y
posteriormente introducirlo en bacterias. 4) cultivar las bacterias para conseguir gran número
de copias de los plásmidos. 5) Los plásmidos se extraen y purifican. 6) Mediante un proceso
de transcripción a partir de estos plásmidos se consiguen numerosas réplicas de ARN
complementarias a nuestra secuencia de interés, que será también complementaria a la
secuencia del ARN mensajero que queremos detectar. El resultado de la transcripción
realizada repetidas veces es un gran número de cadenas de ARN denominadas sondas.
Durante la síntesis de la sonda es cuando se añaden los nucleótidos conjugados con las
moléculas marcadoras que nos servirán para detectarla una vez la hibridación se haya
producido.

Southern blot y Northen Blot

La técnica de Southern blot la desarrolló Edwin Southern en 1975; es una estrategia estándar
para analizar DNA previamente digerido con enzimas de restricción. Esta técnica se utiliza
para determinar la presencia de un gen o fragmentos del DNA específicos en una mezcla de
ácidos nucleicos extraídos con anterioridad. Se basa en la aplicación de dos procesos
fundamentales: la desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del DNA y
la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este fundamento es compartido por
todas las técnicas de hibridación. El procedimiento se da de la siguiente forma; primero se
aísla el DNA de cualquier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, se digiere con
enzimas de restricción (una o dos) y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de
agarosa, luego el DNA se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso
químico (álcalis), a continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido,
como membranas de nitrocelulosa o de nailon, Por último, para identificar uno o más
fragmentos entre millones, se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula
reportera, La cual emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado
con placas de rayos X. La emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de
interés, por otra parte, la Northen Blot es la contraparte del Southern blot y como ácido
nucleico se utiliza RNA en lugar de DNA. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se
utilizan enzimas de restricción, ya que las moléculas de RNA son más pequeñas y para su
análisis no requieren su fraccionamiento. Sin embargo, prácticamente comparten todos los
demás pasos.
Dot blot
Esta es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon
como soporte sólido, tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican
directamente a la membrana sin realizar la electroforesis, La fijación se hace por lo general
con vacío y en un molde con forma de punto. Para luego realizar todos los pasos
consiguientes para la hibridación; desnaturalización del ADN por álcalis, proceso de
prehibridación donde se adiciona un ADN generalmente de esperma de salmón con el objetivo
de evitar la hibridación de las sondas con secuencias diferentes a la objetivo, así cuando se
adicionan las sondas estas desplazan el ADN de salmón al ser más afines al gen, para
finalizar se realiza una autoradiografia para visualizar la hibridación.

Hibridación in situ
Este es un método histoquímico que emplea a la biología molecular para identificar
componentes tisulares en una laminilla que puede observarse al microscopio. A diferencia de
Southern blot y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la extracción de ácidos
nucleicos, sino que en el mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e
hibridación; de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). El primer paso para la hibridación
es la preparación y fijación del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos nucleicos lo
más íntegramente posibles, mantener la morfología del tejido y permitir una accesibilidad
suficiente para que la sonda penetre (normalmente se puede usar un portaobjetos como
soporte sólido), la fijación con formalina, seguida de una inclusión con parafina es un método
bastante usado, para la adhesión, por lo general se utiliza gelatina crómica o polilisina. Antes
de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCl que extrae proteínas e hidroliza parcialmente
las secuencias diana y proteinasa K que incrementa la penetración y la accesibilidad de la
sonda, también se someten a una postfijación con paraformaldehído que incrementa la
especificidad de la señal. Se realizan diferentes lavados para remover las sondas que no
hibridaron y finalmente se procede a la detección; En el caso de sondas radiactivas se
realizará autoradiografía, en caso del uso de sondas no radiactivas, las laminillas se incubarán
con un anticuerpo secundario dirigido contra la sustancia con la que estaba marcada la sonda.

Microarreglos de ADN y ARN

La tecnología de microarreglos se utiliza para estudiar la expresión de muchos genes a la vez.
Consiste en colocar miles de secuencias génicas en lugares determinados sobre un
portaobjetos de vidrio llamado chip. El apareamiento de los ácidos nucleicos en el chip con la
muestra a analizar puede utilizarse para identificar cambios en la expresión de los genes
ocurridos en las células en condiciones determinadas. Los microarreglos de ADN pueden ser
fabricados en cualquier laboratorio, sin embargo se requiere una gran inversión de recursos
para lograr este objetivo, por lo que es recomendable adquirirlos directamente de un
fabricante especializado, una vez adquirido el chip (específico para la prueba que se desea
realizar), se puede proceder; primero se debe extraer el RNA para posteriormente realizarle
una retrotranscripción y obtener cDNA, marcarlo con las etiquetas y purificarlo, luego se
realiza el proceso de hibridación cubriendo la superficie del chip con un cubreobjetos y
colocándolo en la cámara de hibridación, por último se debe obtener la imagen producida por
la fluorescencia de los spots que fueron reconocidos por el cADN marcado, para detectar
dicha fluorescencia se necesita contar con un lector para microarreglos de preferencia con
tecnología confocal.
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