GUIÓN SEMINARIO GENÉTICA

SECUENCIACIÓN SANGER

HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN SANGER - DIAPOSITIVA 3 - Vale

● En 1977: Frederick Sanger desarrolló el método de secuenciación de ADN

conocido como método de Sanger.
● En 1979: Dos años más tarde empleó esta técnica para secuenciar el
genoma del bacteriófago Phi-X174, el primer ácido nucleico secuenciado
totalmente en la historia. Realizó este trabajo manualmente, sin ayuda de
ningún automatismo.
● Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos como el
Proyecto Genoma Humano, y por él se le concedió su segundo Premio Nobel
en 1980, que compartió con Walter Gilbert.
● En 1990: Inició el proyecto genoma humano y se puso como objetivo concluir
en 15 años.

CONCEPTOS PREVIOS - DIAPOSITIVA 4 - Vale

- Secuenciar: Conocer la secuencia concreta de los nucleótidos que componen

cualquier ácido nucléico.
- Dideoxinucleótidos: Nucleótidos que carecen del grupo 3’-OH, cuando uno de
ellos es incorporado por la ADN polimerasa se interrumpe la síntesis de la
nueva hebra.
- ddNTP: Dideoxinucleótido trifosfato, el cual cuenta con un grupo H en el lugar
3´
- dNTP: Deoxinucleótido, el cual cuenta con un grupo OH en el lugar 3´
- Fluorocromos: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación
para crear contraste

QUE ÉS - DIAPOSITIVA 5 - Vale

Para empezar a explicar de qué se trata este proceso, en términos generales

1. Se debe desnaturalizar la secuencia de ADN de interés, colocándola en una

fuente de calor.
2. Se diseña un primer para la cadena complementaria del ADN y con ayuda de
la ADN polimerasa se comienza a polimerizar la cadena a partir de los
dNTP´S, estos dNTP ́S cuentan con un isótopo con radioactividad para la
 visualización en un gen a interés, y se usa también una variante de las
anteriores moléculas llamada dideoxinucleótido (ddNTP).
3. Entonces se toma una molécula de ADN complementario, y la DNA
polimerasa inicia la polimerización tomando dNTP´S del medio para hacer
una nueva hebra de ADN hasta que se encuentra con un ddNTP en donde la
polimerización se detiene, porque a este ddNTP ya no se le podrán unir más
dNTP´s y se libera la cadena.
4. En la siguiente diapositiva podrán ver este proceso más detallado

DIAPOSITIVA 6. - Katherine

Así es Valeria. Entonces aquí observamos en el paso 1 y 2 cómo se desnaturaliza el

ADN, trayendo como resultado una cadena codificante y una cadena
complementaria. En la imagen 3 observamos que a partir de un primer con ayuda de
la ADN polimerasa se empieza a polimerizar la cadena codificante de interés
durante este proceso se presentan varios puntos de corte de acuerdo al ddNP que
se encuentre en el envase; por ejemplo en el tubo 1 el ddNTP que se tá utilizando es
el de la guanina y es por eso que los 2 puntos de corte que observamos son
específicamente en guanina; liberándose así 2 cadenas. Seguidamente en el tubo 2
se encuentra el dideoxinucleótido de timina y se encuentran 3 puntos de corte
diferentes específicamente en lo que en la cadena codificante sería timina. Lo
mismo sucede en el tubo 3 para la citocina y en el tubo 4 para la adenina.
Seguidamente, todos estos fragmentos se corren en un gel de poliacrilamida, en
donde se organizan por tamaño, los más livinas se encuentran más abajo y los
fragmentos más pesados se encuentran más arriba.. explicar dibujo y así es como
se obtiene la cadena codificante de interés :)

DIAPOSITIVA 7. - Katherine y Kevin

Actualmente este proceso se ha automatizado, utilizando fluorocromos diferentes

para cada ddNTP y de esta forma se realiza electroforesis capilar, en donde la
lectura se lleva a cabo por una fuente de luz que excite los fluorocromos y un
detector que lea los colores, finalmente se observarán picos que determinarán el
orden de los nucleótidos.
Explicación de la Imagen:

Para la secuenciación automatizada se requiere el primer (secuencia conocida),

ADN-polimerasa, dNTP (Desoxinucleótidos), ddNTP (dideoxinucleótidos) y la
cadena complementaria (Secuencia desconocida). Pero a diferencia del método
estándar de la secuenciación de Sanger, en la automatizada:

● Los dideoxinucleótidos van a estar unidos a un fluorocromo con un color

específico para cada uno: ddTTP (Rojo), ddCTP (Azul), ddATP (Verde), ddGTP
(Rosa).
● El proceso de polimerización se hará a través de la PCR (Reacción en cadena
de la polimerasa) en un mismo tubo.

Ahora bien, como se observa, se van a ir formando cadenas de ADN que difieren en
longitud, posteriormente, se les realizará una electroforesis capilar, por medio de la
cual se va a utilizar una fuente de luz (Un láser) que excite a los fluorocromos y un
detector el cual permita la lectura de los colores. Esta información es captada por un
computador que por medio de un sistema realizará el cromatograma, que permite
dilucidar la secuencia de la cadena de ADN desconocida.

DIAPOSITIVA 8 - Kev

Cromatograma

Como se venía mencionando, a partir de los cromatogramas se obtiene la secuencia de

nucleótidos. Pero como este proceso lo hacen automáticamente los programas, conviene
revisarlo manualmente porque en muchas ocasiones se producen fallos al asignar las
bases.

Buen
cromatograma
Errores en los cromatogramas

Cromatograma con ruido

Posibles causas del ruido de fondo son: una contaminación de otro ADN o una
contaminación con otro cebador.

Pérdida de resolución

Incluso las buenas secuencias pierden resolución al avanzar la secuencia. Este es uno de
los motivos que hacen que las lecturas no tengan más de 700-800 pb.

DIAPOSITIVA 9 - Kev

● Secuenciar consiste en conocer la secuencia concreta de los nucleótidos que

componen cualquier ácido nucleico (ADN o ARN).

● La secuenciación Sanger se basa en sintetizar de forma secuencial, una

hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple. Se necesita la
presencia de ADN polimerasa, un primer, cuatro deoxinucleótidos y 4
dideoxinucleótidos.

● Permitió obtener fragmentos secuenciados de diferente tamaño, y con la

electroforesis dilucidar la secuencia.
 ● Con las técnicas fluorescentes y la electroforesis capilar, la secuenciación
Sanger se volvió más eficaz. Dando origen al inicio de las tecnologías de
secuenciación de primera generación.

● El método automatizado supuso mejorar la técnica en tres aspectos

principalmente: El proceso tiene lugar en un mismo tubo, PCR para llevar a
cabo la reacción de polimerización y la incorporación de la electroforesis
capilar en un gel de poliacrilamida.

● En la actualidad, la secuenciación Sanger ha sido reemplazada por nuevas

estrategias. Sin embargo, sigue siendo utilizada a pequeña escala.

● La obtención de la secuencia a partir de los cromatogramas es realizada

automáticamente, pero se recomienda revisarla manualmente.

https://www.youtube.com/watch?v=oeJoTZCRrvU

RESULTADOS - Kev
● Secuenciar consiste en conocer la secuencia concreta de los nucleótidos que
componen cualquier ácido nucléico (ADN o ARN)
● La secuenciación Sanger se basa en sintetizar de forma secuencial, una
hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple. Se necesita la
presencia de ADN polimerasa, un primer, cuatro 2’-deoxinucleótidos y 4
dideoxinucleótidos.
● Permitió obtener fragmentos secuenciados de diferente tamaño, y mediante
electroforesis poder dilucidar la secuencia.
● Al incorporar técnicas fluorescentes, el diseño de fluoróforos, los avances en
enzimología y la electroforesis capilar, el método Sanger se volvió más
eficiente y pasó a llamarse el “método de Sanger automatizado”, siendo así el
inicio de las tecnologías de secuenciación de primera generación.
● El uso de ddNTPs marcados con cuatro fluoróforos distintos, permitió llevar a
cabo todo el proceso en un mismo tubo, a diferencia del método original que
necesitaba cuatro tubos.
● Con el descubrimiento de polimerasas resistentes a altas temperaturas, fue
posible utilizar la técnica PCR para la reacción de polimerización.
● En la actualidad, la secuenciación Sanger ha sido reemplazada por nuevas
estrategias. Sin embargo, sigue siendo utilizada a pequeña escala
● La obtención de la secuencia a partir de los cromatogramas es realizada
automáticamente, pero se recomienda revisar manualmente..

PROYECTO GENOMA HUMANO 25 AÑOS DESPUÉS

HISTORIA - Made

Para seguir con el tema del PGH es bueno saber un poco de la historia de este
proyecto.
El PGH tuvo sus orígenes ideológicos a mediados de los 80, pero sus raíces
intelectuales se remontan mucho más atrás.

Toda esta historia empieza desde 1911 …

→ 1911: Alfred Sturtevant creó el primer mapa genético (Cartografía genética) de

Drosophila

→ 1953: Descubrimiento de la estructura de doble hélice de la molécula del ADN

por Francis Crick y James Watson.

→ 1970: Frederick Sanger desarrolló técnicas para secuenciar el ADN.

→ 1986-1987: Se estableció un proyecto inicial del genoma en 1987, en donde un

año atrás (1986) el Departamento de Energía (DEO) de los Estados Unidos se
involucró con intención de proteger el genoma de las mutaciones génicas.

→ 1988: el Congreso de los Estados Unidos financió al NIH y al DEO(National

institutes of Health) para poder embarcarse en una exploración más a fondo de este
proyecto, en donde se firmó un memorando de entendimiento con la intención de
"coordinar investigaciones y actividades técnicas relacionadas con el genoma
humano".

→ 1990: Se concluyó la etapa de planificación inicial con la publicación de un plan

conjunto de investigación, "Understanding Our Genetic Inheritance: The Human
Genome Project, The First Five Years, FY 1991-1995”

→ 1993: Se actualizó el nuevo plan del PGH con la llegada y el empleo de mejores
técnicas de investigación, incluido el uso de polimorfismos de longitud de los
fragmentos de restricción, la reacción en cadena de la polimerasa, los cromosomas
artificiales bacterianos y de levaduras, y la electroforesis de campo pulsante,
hicieron posibles rápidos avances iniciales.

→ 1993: el NCHGR (National Human Genome Research Institute) estableció una

División de Investigación Intrainstitucional (Division of Intramural Research, DIR), en
la que se desarrolla y utiliza tecnología genómica para estudiar enfermedades
específicas y complejas.
→ 1997: el NCHGR fue acreditado plenamente como instituto del NIH,
convirtiéndose en el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano
(National Human Genome Research Institute, NHGRI)

→ 2000: Se anunció que la mayoría del genoma humano había sido, de hecho,
secuenciado, seguido por la publicación del 90% de la secuencia de los tres mil
millones de pares de bases del genoma en la revista Nature.

GENOMA - JULI

Antes de seguir hablando del proyecto genoma humano, es importante tener en

cuenta ¿Qué es el genoma?

Genoma es el conjunto de material genético (es decir, genes) que tiene un

organismo o especie en particular

Genoma humano es por lo tanto → Todo el conjunto de genes que posee el ser
humano

¿QUÉ ES? - Juli

Diapo 15 El PGH fue un proyecto internacional de investigación científica el cual

tenía 2 objetivos:

1. Secuenciar el genoma del ser humano → Conocer toda la secuencia de

ADN de la especie humana *Ya se tenía el conocimiento de la existencia de
las 4 bases nitrogenadas* → Pero ahora lo que se quería saber era cómo
estaban ordenadas en todo el genoma.

2. Realizar mapeo genético → Conocer exactamente en qué parte de qué

cromosoma se encontraba cada gen de los aproximadamente 20.000 genes
que tenemos.

El proyecto tenía como fecha límite 15 años (de 1990 a 2005), para lo cual se
invirtieron 3 millones de dólares y se tuvo la participación de muchos científicos de
diferentes nacionalidades, diferentes universidades alrededor del mundo. El país
que lideró este proyecto fue principalmente Estados Unidos pero aún contemplado
para el 2005, el proyecto finalizó 2 años antes de lo esperado en 2003.

Como dato tenemos que, cuando inició el proyecto se pretendía registrar 80.000 -
100.000 genes humanos que se creía en ese entonces que teníamos, pero a
medida que se fue secuenciando nuestro ADN, ese número de genes proyectado
fue disminuyendo hasta que finalmente se comprobó que eran alrededor de 20.000 -
25.000 genes los que componen a la especie humana.
El producto final del PGH le dió al mundo un recurso de información detallada sobre
la estructura, organización y función del conjunto completo de genes humanos. Fue
como haberle dado a la humanidad un libro con las instrucciones (genéticas
claramente) sobre su funcionamiento como especie.

LOGROS DEL PGH - Juancho

Adoptar alianzas:.
El adoptar alianzas permitió fomentar colaboraciones entre investigadores e
instituciones dentro de un mismo continente, como es el caso del continente
Africano gracias a la iniciativa Human Heredity and Health in Africa, causando que
se facilite el intercambio de experiencias, infraestructura y herramientas para el
análisis de datos dentro de una misma investigación.
Dejando a un lado los logros e investigaciones individuales que se esforzaban de
forma aislada a responder un pequeño conjunto de preguntas científicas y
comprende de que el uso compartido de datos y recursos puede beneficiar a todos,
como se ha evidenciado en los proyectos:

● Microbioma humano, en el cual se utiliza la secuenciación del genoma, entre

otras técnicas, para estudiar comunidades microbianas.
● The cancer genome Atlas, en el cual se está caracterizando las mutaciones
responsables del cáncer.
● Proyecto 1000 genomas, en el cual se llevó a cabo la catalogación de
variantes de secuencia en el genoma humano.

Maximizar el intercambio de datos:

Otro logro que se ha visto a través del proyecto genoma humano es maximizar el
intercambio de datos.
Se han establecido políticas que acortan el tiempo entre la generación y la
publicación de datos, haciendo que se presente una mayor cantidad de datos de la
secuenciación del genoma que se esté investigando para comprender las variantes
genómicas comunes en cientos o miles de personas, revelando variantes asociadas
a algún rasgo de interés en la población general.
Se implementó una Política de intercambio de datos genómicos expansiva, así
como también se propuso nuevos recursos, como el data commons para albergar
datos publicados y la alianza para la genómica y la salud; un Marco internacional
para intercambio de datos genómicos relacionados con la salud.

Planificar el análisis de datos:

Con el diseño temprano de planes para el análisis de datos, permite informar acerca
de estrategias adecuadas para el desarrollo de la investigación, permitiendo analizar
y llevar un registro de la información como se ha llevado a cabo estos últimos años
en varios proyectos de genómica, por ejemplo, el proyecto 1000 genomas y el Atlas
del genoma del cáncer. Logrando así un menor esfuerzo y menor estrés al momento
de analizar los datos.

Victor

Priorizar el desarrollo tecnológico:

Es otro de los logros que tuvo el proyecto genoma humano. Este es el desarrollo de
manera muy rápida de numerosas tecnologías asociadas al estudio del genoma.
Dentro de estos tenemos avances a nivel molecular, químico, físico, computación y
robótica.
Estás innovaciones han ayudado a formar o diseñar estrategias utilizadas en
métodos y avances revolucionarios, como:

● Los instrumentos de secuenciación del genoma humano. Además, de

estudios rápidos en la búsqueda de tratamientos potenciales durante brotes
infecciosos (ejemplo COVID 19)
● Adición de genomas humanos y otras especies

Abordar las implicaciones sociales de los avances:

Los fundadores del PGH reconocieron que las investigaciones obtenidas en el mapeo y
secuenciación del genoma podrían tener profundas implicaciones para la sociedad, por lo
que este se convirtió en el primer proyecto de investigación a gran escala que incluyó un
componente para la investigación de cuestiones sociales.
Esta rama del proyecto llamada investigación ELSI (implicaciones éticas, legales y sociales)
fue fuertemente financiada, algo que no se había visto antes en alguna otra investigación
bioética.

Las actividades de vanguardia en la actualidad en proyectos de esta gama tienen que ir

acompañadas de consideraciones sociales y éticas (Ej: Edición de genes CRISPR/Cas9s
para alterar los genomas humanos y de otras especies).

El PGH incluyó un programa específico de bioética, algo que la mayoría de proyectos

basados en consorcio no tienen y este es un componente clave en investigaciones de este
calibre.

Ser audaz pero flexible:

Los objetivos del PGH fueron audaces ya que no había una exactitud de cómo se
mapear y secuenciar el genoma humano.

El éxito de este proyecto fue la “apertura mental” de sus científicos y las pausas
para realizar balances regularmente, entre otros.
Con esto se logra concluir que los grandes proyectos que tengan metas atrevidas
podrán prosperar, siempre que los objetivos generales se basen en hechos
explícitos, métricas de calidad y evaluaciones. Esta fórmula se ha convertido en la
norma para varios proyectos a gran escala, entre ellos la Iniciativa BRAIN y la
Iniciativa de Medicina de Precisión.
*Iniciativa BRAIN* → mapear toda la actividad neuronal del cerebro
*Iniciativa de Medicina de precisión* →

En resumen …

→ Un legado importante del PGH sería una nueva forma de hacer ciencia, la ayuda
en múltiples campos investigativos y resaltando el de la salud (Entender cuales son
los mecanismos moleculares de muchas enfermedades, la innovación en cuanto al
diagnóstico y el tratamiento del cáncer, y otros avances biomédicos)

→ La historia del PGH proporciona un recordatorio valioso de que algunos de estos

avances darán paso a cambios fundamentales a la forma de cómo se realiza la
investigación.

→ Este proyecto avanzará a medida que se lanzan nuevas grandes iniciativas,

dichos programas deberían ser un componente clave para el proyecto de genoma
humano.
→ Las consideraciones sociales y éticas son factores importantes y necesarios a
tener en cuenta en las investigaciones.
→ El PGH dejó un legado importante para la ciencia y marcó un antes y después en
la forma de entendernos como seres humanos. Aportó información valiosa para
múltiples campos.