DIALOGO SEMINARIO

TEMA: cuando usar cada prueba genética

GENOTIPIA
Qué es el diagnóstico genético.

El diagnóstico genético son todas las acciones que se llevan a cabo para detectar o
determinar las causas genéticas de una enfermedad, sin embargo, existen métodos
complejos y esto es debido a la cantidad material genético que los seres humanos
poseen. Para el diagnóstico genético se realiza una consulta con el consejo genético,
donde se recoge la información clínica como familiar del paciente, para determinar el
patrón hereditario de la enfermedad y si es una patología conocida. Entonces, a través
del estudio genético:
 ¿Qué busco? → Qué enfermedad tenemos delante y cuál es el patrón de
herencia en esa familia.
 ¿Dónde lo busco? → En qué región del genoma tengo que ir a buscar la
mutación causante de la enfermedad.
 ¿Cómo la busco? → Qué técnica tengo que emplear, de todas las que conozco,
para ser capaz de diagnosticar genéticamente esa enfermedad.

El genetista es el que decide qué técnica aplicar cuando corresponde, debido a que no
hay técnica universal, se debe aplicar en función al tipo de mutación asociada y dentro
de las más frecuentes están:
- Mutaciones puntuales.
- Reordenamientos cromosómicos.
- Mutaciones dinámicas.

Cuando se trata de análisis genómico donde es necesario buscar en todo el genoma a

la vez, para ello existen las técnicas CGH array utilizada en el reordenamiento
cromosomico (deleciones/duplicaciones) y NGS (secuenciación masiva) para detectar
mutaciones puntuales.

Mutaciones dinámicas.
Las mutaciones dinámicas consisten en la expansión y el aumento del número de
repeticiones de un trinucleótido, en las poblaciones existe un número que varía de
unas personas a otras, sin embargo, las personas afectadas por la enfermedad tienen
un número más elevado de estas. Este tipo de mutaciones están asociadas a
enfermedades neurológicas como Huntington, SCAs, distrofia miotónica, ataxia de
Friedreich y X-frágil.

Las mutaciones tienen dos características:

 Estabilidad inter e intrageneracional: el número de repeticiones en los alelos
es tan alto que en la descendencia aumenta más.
 Anticipación génica: debido a que la enfermedad es proporcional al tamaño del
alelo, y como en cada generación aumenta el tamaño de la expansión, los hijos
 suelen presentar la enfermedad antes que sus padres y de forma más severa.

El análisis de las mutaciones dinámicas se lleva a cabo mediante PCR o TP-PCR. La PCR
sólo se puede utilizar si el tamaño del alelo es hasta 50 pb, mientras que la TP-PCR
cuando el tamaño de los alelos es mayor de 50 pb, con esta técnica no podremos saber
el número exacto de repeticiones, pero si podremos ver si tiene un alelo expandido de
gran tamaño no detectable por PCR.

Reordenamiento cromosómico (MLPA, CGH array).

Para la detección de reordenamiento cromosómico hay diferentes técnicas al alcance.

- Si se trata de regiones concretas se puede utilizar FISH (citogenética) o MLPA
(molecular).
- Si se requiere buscar en todo el genoma se puede usar el cariotipo (citogenético) o el
CGH array (molecular).

 MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification): está indicado

cuando la enfermedad objeto de estudio ha sido descrita como asociada a
deleciones o duplicaciones. La técnica utiliza poca cantidad de ADN, hay
detección de hasta 45 regiones en una única reacción, resultados en plazos
cortos, más económico que un FISH, se pueden detectar deleciones y
duplicaciones intragénicas de uno o más exones de un gen, deleciones de todo
un gen e incluso más grandes que un gen.
 CGH array: la diferencia entre el CGH array y el microarray es que el cariotipo o
análisis citogenético convencional tiene una resolución limitada y sólo permite
detectar cambios en el número y/o en la estructura de los cromosomas de un
tamaño superior a 5-10 millones de pares de bases (Mb). Sin embargo, con el
cariotipo molecular (microarrays de CGH) es posible detectar simultáneamente
ganancias o pérdidas de fragmentos de ADN responsables de más de 300
síndromes genéticos asociados a retraso mental, autismo, cardiopatías y otras
patologías, en su mayoría no detectables mediante el cariotipo convencional,
detecta duplicaciones y deleciones de 200-50 mil pares de bases (Kb).

Técnicas de diagnóstico genético en mutaciones puntuales

(NextGenDx, Exoma Ad Hoc, Exoma clínico, Exoma completo)

NextGenDx.
Estrategia con mayor precisión diagnositca, basada en la creación la creación de
librerías mediante captura por PCR, la cual permite pasar fácilmente de la
secuenciación de Sanger a la NGS utilizando los mismos cebadores. De esta manera se
asegura mayor especificidad de las regiones que se quieran analizar. Luego se realiza
un análisis bioinformático que lleva acoplado distintas bases de datos para la
interpretación de variantes detectadas. Esta estrategia está dirigida a enfermedades
monogénicas asociadas a genes muy grandes, que por Sanger sería muy costoso de
secuenciar, y a enfermedades multigénicas asociadas siempre que se requiera una alta
precisión diagnóstica.
(NGS permite secuenciar en paralelo millones de secuencias de entre 35-250 pb y
Sanger solo puede secuenciar de 1 a 96 secuencias en paralelo de 650-800 pb.)
Exoma Ad Hoc (Exoma dirigido).
En esta técnica la librería se crea mediante captura por hibridación. Consiste en la
secuenciación y análisis de las regiones codificantes de un grupo de genes específicos o
asociados a un fenotipo clínico concreto. Esta técnica está indicada en los casos que se
pretenda analizar el mayor número posible de genes asociados a un fenotipo clínico
concreto, aunque ello implique la pérdida de un pequeño porcentaje de información
génica en algunas regiones de interés, aunque esto se da en enfermedades con una
heterogeneidad genética media o alta, y en enfermedades con difícil diagnóstico
diferencial o con características clínicas solapantes.

(Facilita la interpretación de los resultados y disminuye los hallazgos incidentales no

solicitados).

Exoma clínico.
En esta técnica también se crea captura por hibridación. Se secuencia la región
codificante de todos los genes ya descritos en el OMIM, que tiene alguna asociación
con enfermedades genéticas. Esta técnica está indicada en los casos clínicamente
inespecíficos que no pueden asociarse a un fenotipo, patología o genes concretos y de
los cuales se trata de obtener un resultado que permita llegar a conclusiones clínicas.

Exoma completo.
Al igual que los otros exomas, esta librería se obtiene de la misma forma. La diferencia
es que aquí no sólo se incluyen genes que se sabe que tienen alguna implicación
clínica, sino que también incluyen los cerca de 20.000 genes de los que consta el
genoma humano. Está técnica se dirige a casos de interés científico con el objetivo de
obtener la mayor cantidad de información posible, con la finalidad de descubrir
variantes nuevas, aunque los resultados también pueden proporcionar datos de
utilidad clínica.

PRUEBA DE UN SOLO GEN

Se prefiere la prueba de un solo gen cuando las características clínicas y otros

resultados de las pruebas de un paciente son típicos de un trastorno en particular y se
establece la asociación entre el trastorno y un gen específico. La sensibilidad clínica de
una prueba de un solo gen es alta porque el fenotipo y otros hallazgos apuntan
claramente a un trastorno que está asociado con un gen. También existe una clara
ventaja interpretativa para el enfoque de un solo gen porque la probabilidad de
descubrir múltiples variantes de confusión de significado clínico desconocido (VUS) es
mínima.  Por ejemplo, el gen FGFR3 es el único que se sabe que está asociado con la
acondroplasia. Prueba de gen único de FGFR3 detecta mutaciones en el 99% de los
pacientes con acondroplasia y, por lo tanto, es el enfoque más eficiente en términos
de costo y tiempo. Sin embargo, el médico debe tener conocimiento de los hallazgos
clínicos y radiográficos de diagnóstico de la acondroplasia para poder seleccionar la
prueba genética correcta.
 PRUEBAS GENÓMICAS INTEGRALES
PANELES MULTIGENICOS

Antes del desarrollo de la secuenciación masivamente paralela (también conocida

como secuenciación de próxima generación), la única forma rentable de probar más de
un gen era la prueba de un solo gen en serie (es decir, la prueba completa de un gen
que podría explicar el fenotipo antes de proceder a la prueba del siguiente gen), una
tarea costosa y que requiere mucho tiempo, de enfoque con un rendimiento
potencialmente bajo. En los últimos diez años, las mejoras en las técnicas de
secuenciación paralela masiva han llevado al desarrollo y uso clínico generalizado de
paneles multigénicos. Estos paneles permiten la prueba simultanea de dos o más de
150 genes. Los métodos utilizados en los paneles multigénicos son:
- Análisis de secuencia: proceso por el cual se determina la secuencia de
nucleótidos para un segmento de ADN.
- Análisis de delección/duplicación: pruebas que identifican
eliminaciones/duplicaciones que no son detectables rutinariamente por análisis
de secuencias de codificación y flanqueo intrónico en regiones de ADN.
- Otras pruebas no basadas en secuenciación.

Se pueden tener en cuenta varias consideraciones cuando decidir qué genes se

incluirán en un panel.
- Primero, ciertamente se incluyen genes con una fuerte asociación con la
enfermedad; la capacidad de interpretar los hallazgos de estos genes es mucho
mejor porque hay suficiente evidencia establecida. Es posible que estos genes
ya se ofrezcan en los laboratorios de diagnóstico clínico como una prueba de un
solo gen, pero ofrecerlos como un panel puede ahorrar costos y tiempo.
- En segundo lugar, los genes asociados con trastornos que tienen fenotipos
superpuestos con los de los trastornos primarios en el panel de genes pueden
incluirse con el fin de realizar un diagnóstico diferencial. Por ejemplo, el gen
SLC2A2 para el síndrome de Fanconi-Bickel puede incluirse en el panel de genes
de la enfermedad por almacenamiento de glucógeno porque cuando un
paciente presenta hipoglucemia en ayunas, se consideran los diagnósticos
tanto del síndrome de Fanconi Bickel como de la enfermedad por
almacenamiento de glucógeno.
- Por el contrario, también deberían existir criterios de exclusión. Por ejemplo,
los genes de los trastornos peroxisomales no necesitan incluirse en un panel de
genes de trastornos de almacenamiento lisosómico porque otras herramientas
de diagnóstico pueden ayudar a diferenciar estos dos grupos de trastornos
entre sí.

Existen 2 tipos de paneles multigenicos:

1. Disponibles en el mercado: están diseñados por un laboratorio para incluir
genes comúnmente asociados con un fenotipo amplio (Ej: Ataxia, discapacidad
 intelectual, miocardiopatía) o un síndrome reconocible con heterogeniedad
genética (son variantes patogénicas que en más de un gen pueden causar un
fenotipo, ej: Síndrome de Noonan).
2. Personalizado: son genes seleccionados por un medico para analizarlos
mediante secuenciación clínica. El resultado es informado al medico que realizo
el pedido mientras que los genes restantes secuenciados que no son solicitados
por el medico no se analizan ni se incluyen en el informe final, esto trae de
ventaja que el análisis reflejo de otros genes específicos puede ser mas rápido y
menos costoso y por lo general no se requiere una muestra adicional del
individuó que se esta probando.

Algunas desventajas de los paneles multigenicos personalizados comparado con

los disponibles en el mercado:
 La sensibilidad clínica no se conoce y puede ser menor que la de los
paneles más grandes.
 No pueden detectar deleciones o duplicaciones más grandes dentro de
los genes de interés.
 No dispone clínicamente de un panel multigenico estándar.

Secuenciación clínica del exoma

El exoma humano incluye todas las secuencias codificantes de ADN nuclear,
aproximadamente 180.000 exones que se transcriben en ARN maduro. (Tenga en
cuenta que el ADN mitocondrial no está incluido en el exoma). El exoma, que
comprende solo del 1% al 2% del genoma humano, contiene la mayoría de las
variantes que causan enfermedades actualmente reconocidas.
La secuenciación del exoma es una prueba de laboratorio diseñada para identificar y
analizar la secuencia de todos los genes nucleares que codifican proteínas en el
genoma más utilizada para el descubrimiento de genes de la enfermedad
mendeliana. Aproximadamente el 95% del exoma se puede secuenciar con las técnicas
disponibles actualmente. La utilidad diagnóstica de la secuenciación del exoma ha sido
consistentemente del 20% al 30%, es decir, se identifica un diagnóstico en el 20% al
30% de las personas que no habían sido diagnosticadas previamente, pero tenían
características que sugirieron una condición genética, además, desde una perspectiva
económica, un estudio reciente ha demostrado que, en comparación con las pruebas
múltiples de un solo gen o de bajo rendimiento, la ES tiene el potencial de
proporcionar un costo beneficio significativo para estos pacientes.
En los últimos cinco años, la secuenciación del exoma se ha vuelto cada vez más
disponible clínicamente porque las mejoras continuas en las herramientas
bioinformáticas y de secuenciación masivamente paralelas para el análisis de datos
han reducido el costo y el tiempo de respuesta y los informes de resultados
clínicamente procesables han llevado a una mejor cobertura por parte de los seguros
médicos. Sin embargo, los kits de exomas disponibles en el mercado se diseñaron para
cubrir todo el exoma, pero no ofrecen una cobertura completa de todos los exones de
los genes, incluido el subconjunto de genes asociados a enfermedades conocidas y
para que la ES pase de ser una prueba de detección a una prueba de primer nivel
independiente, primero debe ofrecer una cobertura completa de todos los exones o de
al menos los genes asociados con la enfermedad conocida, dado que una verdadera
prueba médica integral de ES debe proporcionar una cobertura completa para todos
los exones de todos los genes conocidos relevantes para la enfermedad, mientras
mantiene la cobertura para los 18.000 genes restantes y tendrá la capacidad de
detectar variantes en toda la mutación.

Secuenciación clínica del exoma: preguntas frecuentes. (solo leerlo)

1. ¿Cuándo proporciona la secuenciación del exoma el mejor valor de prueba?

Cuando las características clínicas de un paciente no son muy sugestivas de una
condición genética conocida, cuando sugieren varias afecciones genéticas que no están
incluidas en un  o cuando las características clínicas de un paciente y los antecedentes
familiares sugieren una afección mendeliana altamente penetrante que no puede
identificarse solo por el fenotipo.

2. ¿Qué tipos de trastornos se pueden diagnosticar de forma fiable mediante la

secuenciación del exoma?
 Trastornos mendelianos causados por variantes sin sentido que son raros en la
población; y se han reportado previamente como patógena
 Trastornos mendelianos causados por pequeñas inserciones o deleciones (<50
pb) dentro del ADN codificante no repetitivo

3. ¿Qué tipos de trastornos no se identifican de forma fiable mediante la

secuenciación del exoma?
 Trastornos genéticos que pueden no reconocerse durante el análisis de la
secuenciación del exoma debido a un patrón de herencia inesperado:
o Trastornos con penetrancia incompleta o edad variable de inicio (p. Ej.,
Variante presente en un padre no afectado).
o Trastornos con patrones de herencia no informados previamente (p.
Ej., Herencia autosómica dominante en un trastorno informado
previamente como autosómico recesivo )
 Trastornos para los que no se han informado genes asociados y / o variantes
patogénicas:
o Trastornos mendelianos asociados con múltiples genes no identificados.
o Trastornos causados por variantes patogénicas que no están descritas
como asociadas a enfermedades en la literatura.
 Trastornos que no se conocen como genéticos:
o Condiciones con una etiología no genética (p. Ej., Síndrome de alcoholismo
fetal).
 o Condiciones para las que no existe una etiología genética conocida.

Secuenciación clínica del genoma

El genoma humano incluye todas las secuencias de ADN nuclear y mitocondrial
codificantes y no codificantes. El ADN nuclear codifica la mayoría de los más de 20.000
genes humanos (El ADN mitocondrial codifica 37 genes). La mayoría de los más de 3,2
millones de pares de bases que componen el genoma humano son secuencias
repetitivas de ADN o no codificantes, incluidos los ARN no codificantes, variantes en las
que se han atribuido a trastornos hereditarios específicos.
La secuenciación del genoma es una prueba de laboratorio diseñada para identificar y
analizar la secuencia de todo el ADN nuclear codificante y no codificante. El ADN
mitocondrial es parte del genoma; sin embargo, la secuenciación mitocondrial a
menudo se ordena como una prueba de laboratorio separada.
La secuenciación del genoma sigue siendo significativamente más costosa que la
secuenciación del exoma debido al alto costo del análisis de datos. Sin embargo, la
utilidad diagnóstica (20% - 30%) es aproximadamente la misma para los dos métodos
de prueba: aunque la secuenciación del genoma puede identificar variantes fuera de
las regiones codificantes, la determinación de la patogenicidad de estas variantes a
menudo no es posible. Por lo tanto, la mayoría de las variantes patogénicas
confirmadas identificadas por secuenciación del genoma se encuentran dentro de los
exones.

Secuenciación clínica del genoma: preguntas frecuentes.

1. ¿Cuándo proporciona la secuenciación del genoma el mejor valor de prueba?

 Las características clínicas en un probando sugieren condiciones genéticas
conocidas que no están incluidas en un panel multigénico o detectables
por secuenciación del exoma .
 Las características clínicas en un probando parecen ser compatibles con
el mosaicismo somático, pero no son muy sugestivas de un síndrome conocido.

2. Beneficios y limitaciones de la secuenciación del genoma

La secuenciación del genoma se realiza típicamente mediante
la secuenciación de próxima generación de ADN genómico fragmentado. Las
técnicas de secuenciación del genoma tienen una cobertura no estandarizada y
muy variable.
Si bien la secuenciación del genoma es significativamente más costosa que la
secuenciación del exoma , tiene distintas ventajas:
 Preparación de muestras más sencilla (no se necesitan estrategias de
enriquecimiento de secuencias para apuntar al ADN codificante, lo que da
como resultado una cobertura más uniforme [profundidad de lectura] en las
regiones de codificación).
 La capacidad de identificar variantes estructurales y puntos críticos
de cromosomas en regiones no codificantes.
La cobertura del genoma es inferior al 100% y varía según el laboratorio. 
Aunque la secuenciación del genoma puede identificar variantes fuera de las
regiones codificantes, la mayoría de las variantes patogénicas confirmadas
identificadas mediante la secuenciación del genoma se encuentran dentro
del exoma. La utilidad diagnóstica de la secuenciación del exoma y la secuenciación
del genoma (~ 20% -30%) sigue siendo similar. A medida que se identifiquen más
variantes patogénicas no codificantes, la sensibilidad clínica y el valor de la
secuenciación del genoma deberían aumentar.

3. ¿Qué tipos de trastornos se pueden diagnosticar de forma fiable mediante la

secuenciación del genoma?
 Trastornos mendelianos causados por:
o Variantes sin sentido o sin sentido que son raros en la población; y se han
reportado previamente como patógena en la bibliografía o HGMD ® (Human
Gene Mutación base de datos).
o Pequeñas inserciones o deleciones (<50 pb) dentro del ADN no repetitivo
que han sido reportados previamente como patógenos en la literatura; o
interrumpir un gen reportado en HGMD ® (Human Gene Mutación base de
datos).

4. ¿Qué tipos de alteraciones genéticas no se identifican de manera confiable

mediante la secuenciación del genoma?
Alteraciones que:
 Influyen en la expresión génica sin cambiar la secuencia del ADN (p. Ej., Errores
de impresión , heterodisomía uniparental );
 Están presentes en una región de ADN muy repetitiva que es difícil de
secuenciar (p. Ej., Expansiones y contracciones de repetición de nucleótidos );
 Involucrar un gen que es altamente homólogo a otros miembros de la familia
de genes o un pseudogen ;
 Están presentes en el ADN mitocondrial y no en el ADN nuclear;
 Son cambios somáticos del mosaico (es decir, el cambio genético está presente
en un pequeño porcentaje de células y ausente en un gran porcentaje de
células); por lo tanto, las llamadas de bases no superan los umbrales de calidad
o el cambio genético no estaba presente en las células de las que se extrajo el
ADN.

5. ¿Qué tipos de trastornos no se identifican de forma fiable mediante la

secuenciación del genoma?
 Trastornos para los que no se han informado genes asociados y / o variantes
patogénicas:
o Trastornos mendelianos asociados con múltiples genes no identificados.
o Trastornos causados por variantes patogénicas que no están descritas
como asociadas a enfermedades en la literatura.
  Trastornos que no se conocen como genéticos:
o Condiciones con una etiología no genética (p. Ej., Síndrome de
alcoholismo fetal).
o Condiciones para las que no existe una etiología genética conocida.
MICROARREGLO CROMOSOMICO

Una Micromatriz Cromosomia (CMA) es una prueba genética molecular que se utiliza
para detectar Variantes de Numero de Copias (CNV) (que son deleciones (perdida) o
duplicaciones (ganancia) de material cromosómico que varían en tamaño desde
aproximadamente 1 kb, hasta múltiples megabases (Mb)).

Según el tamaño y la ubicación genómica de una CNV, la deleccion o duplicaion puede

contener cero, uno o muchos genes, por lo tanto, las CNV pueden ser benignas,
patógenas o de importancia clínica incierta.

Hay que mencionar que la CMA es más sensible para detectar CNV que el análisis del
cariotipo, que ha sido reemplazo en gran medida por la CMA, a pesar de que el análisis
de cariotipo de alta resolución puede detectar deleciones pequeñas entre 3-5 Mb y
duplicaciones mayores de 5Mb, la CMA puede detectar CNV tan pequeñas como 100
KB.

La sensibilidad de CMA depende:

 Región del genoma cubierta por las sondas seleccionadas.
 Numero de sondas utilizadas.
 Espaciamiento (densidad) de las sondas.

Los tipos mas comunes de CMA son:

- Hibridación genómica comparativa de matriz de oligonucleótido (Oligo aCGH):
Método en el que dos muestras de ADN (una muestra de control y una muestra
de prueba), etiquetadas en diferentes colores fluorescentes, se hibridan en un
solo objetivo para analizar las pérdidas (eliminaciones) o ganancias relativas
(duplicaciones) en el ADN de la muestra de prueba en comparación con el
control. Las matrices de oligo aCGH, específicamente, pueden diseñarse para
detectar CNV tan pequeñas como un solo exón.
- La matriz de genotipado de polimorfismo en un solo nucleótido (Matriz de
SNP): Determinan el genotipo de un individuo en sitios seleccionados de un
solo par de bases en el genoma de esa persona. Estos sitios de un solo par de
bases se seleccionan porque es probable que sean polimórficos (es decir, el
nucleótido en el sitio varía entre los individuos).
- Matriz de combinación de oligo aCGH/SNP: incluye sondas de oligonucleótidos
y sondas para SNP seleccionados, esto permite la detección de isodisomía
uniparental (La situación en la que un individuo hereda dos copias idénticas de
un cromosoma par de un padre y no hereda ninguna copia del otro padre).

USO: la micromatriz cromosómica se recomienda como prueba de primera línea para

personas con retraso en el desarrollo, discapacidad intelectual, anomalías congénitas
multiples y o trastorno del espectro autista, teniendo así un rendimiento diagnostico
del 15-20% en comparación con el cariotipo tradicional que es del 3%.