Universidad Central de Venezuela

Facultad de Farmacia
Cátedra de Análisis Farmacéutico

TEMA 18
CROMATOGRAFÍA

Profa. Joyce Gutiérrez

 OBJETIVOS
 Clasificar los métodos cromatográficos.
 Describir el fundamento básico de los diferentes tipos
de cromatografía, de acuerdo al tipo de fase móvil y
fase estacionaria.
 Describir el fundamento básico de la cromatografía en
columna líquido-líquido.
 Explicar las diferencias entre cromatografía en fase
normal y en fase reversa.
 Seleccionar fases estacionarias y fase móvil según las
diferentes polaridades.
 Indicar aplicaciones de la cromatografía líquido-líquido

 Definir la cromatografía líquido-sólido.

 OBJETIVOS
 Describir el fundamento básico de la cromatografía
líquido-sólido.
 Señalar los adsorbentes y fases móviles más utilizados
en la cromatografía líquido-sólido.
 Seleccionar los adsorbentes activos según la estructura
de los compuestos a separar.
 Seleccionar las fases móviles según la estructura de los
compuestos a separar y la fuerza de los solventes.
 Describir el fundamento de la cromatografía en
superficie plana.
 Señalar los adsorbentes, fases estacionarias líquidas y
fases móviles más utilizadas.
 OBJETIVOS
 Seleccionar adsorbentes activos y fases estacionarias
líquidas según los compuestos a separar.
 Seleccionar fases móviles según los compuestos a separar,
la fuerza y/o polaridad.
 Describir la preparación y activación de las placas.

 Explicar la importancia de la saturación de los tanques.

 Seleccionar las técnicas de desarrollo según los tipos de

compuestos a separar.
 Seleccionar el método de detección a aplicar según la
estructura de los compuestos separados.
 Aplicar en algunos ejemplos la cromatografía en
superficie plana.
QUÉ SIGNIFICA CROMATOGRAFÍA

Mikhail Semenovich Tweet

1872 – 1919

Botánico Ruso que empleó por primera

vez en 1906 el término de
Cromatografía

χρομα y γραφω que significan

"color" y "escribir"
 CROMATOGRAFÍA
Es una técnica que permite la separación de los
componentes de una mezcla debido a la influencia
de dos efectos contrapuestos.

Retención Desplazamiento

Efecto ejercido sobre los Efecto ejercido sobre los

componentes de la componentes de la
mezcla por una fase mezcla por una fase
estacionaria, que puede móvil, que puede ser un
ser un sólido o un líquido o un gas.
líquido anclado a un
soporte sólido.
CÓMO SE PROCEDE

La mezcla se La fase móvil se Desplazando a

deposita sobre hace pasar los
la fase atravesando el componentes de
estacionaria sistema la mezcla

La retención y
Se efectúa la desplazamiento
separación de la a lo largo del
mezcla original sistema
cromatográfico
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
 Depende de la naturaleza de la fase estacionaria
(sólida – líquida) y de la fase móvil (líquida –
gaseosa)
 Cromatografía sólida – líquido
 Cromatografía líquido – líquido
 Cromatografía líquido – gas
 Cromatografía sólido – gas
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
 Dependiendo de la interacción que se establece entre
los componentes de la mezcla y la fase móvil y
estacionaria
 Cromatografía de adsorción
 Cromatografía de partición
 Cromatografía de intercambio iónico

 Tipo de soporte empleado para la fase estacionaria

 Cromatografía de columna
 Cromatografía en capa fina
CROMATOGRAFÍA SÓLIDO – LÍQUIDO O DE
ADSORCIÓN

 Fase estacionaria sólido poroso finamente

granulado (adsorbente) de carácter polar.
 El gel de sílice tiene carácter ácido.
 La albúmina se puede adquirir de carácter neutro,
ácido o básico.
 Fase móvil líquida (eluyente)
 Los componentes de la mezcla deben ser
parcialmente solubles.
 La velocidad de elución de un compuesto aumenta al
aumentar la polaridad de la FM.
 La fase móvil puede ser un solvente o una mezcla de
disolventes.
 Separación con fines analíticos o preparativos.
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Placa de vidrio, plástico

o lámina metálica

Cromatografía de Papel

La fase móvil asciende

a lo largo de la placa,
desplazando a los compuestos
a diferentes velocidades.
FASES ESTACIONARIAS
 Aglutinantes (almidón, carbocimetilcelulosa,
sulfato de calcio).
 Poliamidas

 Florisil (silicato de magnesio precipitado),

 Carbón activo (carbón en polvo),

 Óxido de aluminio (alúmina).

 Gel de sílice (Sílica gel)

HO
Espesor uniforme
Si CH3 de la placa
H3C CH3
 Compuestos
separados

Mezcla de
compuestos

Frente del
solvente

Sistema de
solventes
FASES MÓVILES
Solvente Fuerza del solvente (eº)
Pentano 0,00
Ciclohexano - 0,05
Disulfuro de carbono 0,14
Benceno 0,25
Éter dieltílico 0,38
Cloroformo 0,26
Acetona 0,47
1, 4- dioxano 0,49
Acetato de etilo 0,38
Acetonitrilo 0,50
RF (RATE FACTOR)
Tiene un valor constante para
cada compuesto en condiciones
determinadas.

Se recomienda elegir un disolvente

en el que los compuestos de la
mezcla presenten un Rf medio
entorno a 0,3 – 0,5.
VISUALIZACIÓN DEL CROMATOGRAMA
ANÁLISIS CUALITATIVO

Con revelador

Se puede remojar o rociar

Se seca con una pistola
de aire caliente
Separaciones analíticas
CÓMO SE PUEDEN ELABORAR

Activación a 105°C por 30 min.

HO
Si CH3
H3C CH3

0,1 – 0,3 mm para separaciones analíticas.

0,5 – 2,0 mm para separaciones preparativas
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
PREPARATIVA

 Separaciones cuantitativas

Se raspa la mancha que nos

interesa, se reconstituye el
compuesto y se filtra
PROCEDIMIENTO

Rocío de agentes
reveladores
Luz Ultravioleta

Sembrado de Detección de Determinación

Elución
la muestra compuestos cuantitativa

Comparación visual
Analítica de manchas
Preparativa Detección radiactiva
Medición del área de
la mancha
Fase móvil CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA
Elución
Isocrática Mezcla de compuestos
Arena Se puede realizar por
gravedad o a media presión
(flash chromatography)
Tamaño Sílice Gel
específico Fase estacionaria

Arena Separación y purificación

Algodón de compuestos orgánicos,
sólidos o líquidos, a escala
preparativa.
Existen diferentes
métodos para empacar la
columna cromatográfica
SEPARACIÓN POR COLUMNA Compuesto
más polar
Mezcla de compuestos

F
M

Tiempo de 1er 2do

Compuesto
retención compuesto compuesto
menos polar
Comprobar su contenido, pureza y seguir la separación.
Mx 3 5 7 Mx 9 11 13 Mx 15 17 19 Mx 21 23

Matraz o balón fondo Identificación

Rotaevaporar
redondo tarado
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO – LÍQUIDO O DE
PARTICIÓN

 Fase estacionaria líquida, anclada a un soporte

sólido (incorporación de una cadena hidrocarbonada
larga).
 Fase móvil líquida. La polaridad depende de la naturaleza
de las cadenas hidrocarbonadas

Clorosilano

Silanol Siloxano

Térmicamente estable y difícil de hidrolizar a

valores de pH comprendidos entre 2 y 9
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
Cromatografía Normal Inversa
F. Estacionaria Un líquido de Un líquido de carácter
carácter polar apolar

F. Móvil Se emplean mezclas Es más polar que la fase

Selectividad de la de disolventes estacionaria (mezclas de
separación apolares con agua con disolventes polares
disolventes polares miscibles metanol o
acetonitrilo)

Mezcla de Muy polares Polaridad baja

compuestos
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
 Fase estacionaria

Polímero Grupos Resina de

tridimensional funcionales intercambio
hidrocarbonado iónicos anclados

Cargas eléctricas
contrabalanceadas
móviles

Que pueden ser

intercambiadas por otros de Se debe regenerar la
igual signo en la fase móvil resina antes de utilizarla
TIPOS DE RESINAS INTERCAMBIADORAS
 Cationes
 Ácidas fuertes: Sulfonato.
 Ácidas débiles: Carboxilato.

 Aniones
 Básicas fuertes: Amonio (tipo I).
 Básicas débiles: Grupo amino libre.

Resinas intercambiadoras ácidas débiles adsorben

H+ sobre cualquier catión, y las intercambiadoras
básicas débiles OH- sobre cualquier otro anión
FASE MÓVIL
 El valor de pH tiene influencia en la selectividad
de la separación.
 En las resinas catiónicas pH
 En las resinas aniónicas

 El pH del eluyente debe estar alrededor de 1 o 2

unidades por debajo del valor de pKa en
compuestos básicos, y 1 o 2 unidades por encima
del valor de pKa de los compuestos ácidos.

 Fuerza iónica.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN HPLC

 No tiene limitaciones en cuanto a volatilidad y

estabilidad química como la Cromatografía de gases.

 Se utilizan columnas de diámetro pequeño y empaques

con tamaño de partículas pequeño proporcionando una
gran resolución.

 Permite el intercambio o combinación de solventes de

fases móviles dando gran selectividad.

 Utiliza bombas de alta presión para el suministro de la

fase móvil.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN HPLC

 Se pueden analizar compuestos iónicos, polímeros y

compuestos polifuncionales con alto peso molecular.

 Disminuye el tiempo del análisis.

 Aumenta la separación de una mezcla compleja de

compuestos.

 Es la técnica que se utiliza en la Industria

Farmacéutica.
 GRACIAS
Nunca consideres el estudio como una obligación, sino
como una oportunidad para penetrar en el bello y
maravilloso mundo del saber.

Albert Einstein