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QUIMICA ORGNICA I (LIC.

EN PTICA OCULAR Y OPTOMETRA) SEMINARIO DE CROMATOGRAFA


FUNDAMENTOS La cromatografa engloba a un conjunto de tcnicas de anlisis basadas en la separacin de los componentes de una mezcla y su posterior deteccin. Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. La muestra se introduce en la fase mvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la mvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separacin. Si un componente est la mayor parte del tiempo en la fase mvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho ms lenta. Clasificacin Desde el punto de vista del mecanismo de separacin, los tipos de cromatografa ms relevantes son: a) Cromatografa de adsorcin: La distribucin de solutos entre las fases fija y mvil se rige por procesos de adsorcindesorcin. La fase fija es un slido con gran superficie especfica. b) Cromatografa de particin: La distribucin de solutos es consecuencia del reparto. La fase fija es un lquido con determinadas propiedades. En algunos procesos cromatogrficos intervienen simultneamente fenmenos de adsorcin y particin. Desde el punto de vista de las distintas tcnicas cromatogrficas, las mismas se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria: a) Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son: i) Cromatografa en papel ii) Cromatografa en capa fina b) Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:
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i) Cromatografa de lquidos ii) Cromatografa de gases La cromatografa de gases es til para gases o para compuestos relativamente voltiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de altaresolucin (HPLC, del ingls High Perfomance Liquid Chromatography), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN Como hemos dicho, la separacin de componentes de una mezcla por cromatografa de adsorcin depende del equilibrio de adsorcin-desorcin entre los compuestos adsorbidos en la superficie de la fase slida estacionaria y la fase lquida mvil. La fuerza con que se adsorbe un componente aislado depende de la polaridad de la molcula, de la actividad del adsorbente, y de la polaridad de la fase lquida mvil. La separacin de los componentes de una mezcla depende de los valores relativos del equilibrio de adsorcin para cada uno de ellos. Por lo general, cuanto ms polar es un compuesto, ms fuertemente ser adsorbido en la superficie de la fase slida polar. La Tabla 1 ordena los grupos de solventes orgnicos ms corrientes por el orden de polaridad creciente. Pueden ocurrir alteraciones menores en estas series si el grupo funcional est altamente protegido, por impedimento estrico, por otras partes menos polares de la molcula. Tabla 1: Secuencia de polaridad de compuestos Hidrocarburos Alquenos Eteres Compuestos Halogenados Orden general de polaridad Aromticos Cetonas Aldehidos Esteres Alcoholes, aminas, mercaptanos
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Acidos y Bases dbiles La actividad del adsorbente (poder de adsorcin) depende del tipo de material y del modo cmo se prepar. La Tabla 2 ordena algunos de los adsorbentes ms usuales en orden de actividad creciente. Tabla 2: Adsorbentes para cromatografa de adsorcin Celulosa Almidn Azcar Silicato de magnesio Sulfato de calcio Silica gel Florisil xido de magnesio Oxido de aluminio Carbn activado
Para escoger adecuadamente el adsorbente es necesario el conocimiento previo de

los tipos

de compuestos a separar. Siempre se recomiendan ensayos previos a pequea escala (capa fina). Si se tiene una muestra a separar, sus componentes pueden obtenerse en forma aislada, pasando un solvente o mezcla de los mismos de suficiente polaridad como para arrastrarlos, en forma de bandas separadas, al fondo de la columna de separacin. Las bandas aisladas pueden distinguirse por su color o fluorescencia bajo la influencia de la luz UV, o reaccionar con un indicador coloreado. Tambin suele efectuarse una cromatografa en capa fina (analtica) con una muestra de las bandas aisladas y efectuar un revelado posterior, pudiendo ser ste destructivo o no. El procedimiento ms general es un flujo continuo a travs de la columna (rellena con fase estacionaria polar) de solventes de polaridad creciente para ir eluyendo cada componente individualmente. Los solventes usados generalmente como eluyentes estn ordenados en la Tabla 3 en orden de polaridad creciente.

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Dado que la separacin completa depender de que se establezcan y mantengan las condiciones de equilibrio, la polaridad del sistema de solventes se incrementar muy lentamente, aumentando la concentracin del solvente ms polar que sigue en polaridad al que se est empleando. Tabla 3. Series eluotrpicas (orden de polaridad creciente) Eter de petrleo Ciclohexano Tetracloruro de carbono Benceno Cloruro de metileno Cloroformo ter Acetato de etilo Piridina Acetona n-Propanol Etanol Metanol Agua cido actico Cromatografa en capa fina La cromatografa en capa fina (o CCD: cromatografa en capa delgada; TLC: thin layer chromatography, de las siglas en ingls) es una aplicacin especial de la cromatografa de adsorcin, en la que se utiliza una capa fina de adsorbente soportada sobre una superficie plana, en lugar de una columna rellena. El desarrollo del cromatograma se consigue por el movimiento capilar ascendente del solvente a travs de la capa fina de adsorbente. Los adsorbentes de utilizacin ms frecuente son almina, gel de slice y celulosa. Se deben realizar ensayos con diversos solventes para determinar cul ser el que conduzca a una mejor separacin. La tcnica cromatogrfica se basa en colocar una pequea cantidad de la muestra en una cromatoplaca que se sita en una cubeta con un disolvente
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adecuado que asciende por accin capilar. Los componentes de la muestra se separan al desplazarse por la placa a distinta velocidad, en funcin de su solubilidad en el disolvente y del grado de retencin de los adsorbentes de la placa. El equipo y disposicin bsicos para una cromatografa en capa fina se muestra en la Figura 1. El desarrollo debe ocurrir en una atmsfera saturada del solvente, de otra manera el solvente se evaporara de la placa antes de ser reemplazado por la accin de capilaridad, y la separacin de los componentes no se lograra. La placa se retira de la cubeta antes de que el disolvente rebase su parte superior, se revela y a partir de las manchas obtenidas se calculan los Rf caractersticos de cada componente (relacin de frentes. Calculo de los Rf: A partir de la placa revelada que se muestra, podemos calcular los Rf de los dos componentes. Las distancias que se desplazan los componentes se miden desde el centro de la mancha obtenida hasta la lnea inicial de colocacin de las muestras (lnea de siembra). La distancia que se desplaza el disolvente se mide desde la lnea que alcanz ste en la parte superior de la placa hasta la lnea de siembra (Figura 2). La visualizacin o revelado del cromatograma depender de los tipos de molculas presentes en la muestra original: a) Si los compuestos son coloreados, bastar la inspeccin ocular para distinguir las manchas. b) Si los compuestos no son coloreados existen diferentes opciones: i) un mtodo comn es el uso de vapores de iodo. El cromatograma, desarrollado y seco, se coloca en un recipiente cerrado conteniendo algunos cristales de iodo, el que se adsorbe en las partes del cromatograma donde hay compuestos orgnicos insaturados, apareciendo manchas pardas, debidos a la formacin de complejos de transferencia de carga con el iodo. Es un mtodo no destructivo, ya que puede sublimarse el iodo por calentamiento y recuperarse el compuesto original. Mtodo no destructivo. ii) Son bastantes los compuestos orgnicos que se carbonizan al calentar con cido sulfrico. Se puede pulverizar el cromatograma desarrollado con una

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solucin de cido sulfrico (5%) en metanol y calentando posteriormente en estufa a 100-110C. Es un mtodo destructivo. iii) Si las sustancias presentan absorcin en el UV, se revelan mediante este mtodo no destructivo. iv) Adems pueden utilizarse como reveladores, los agentes especficos utilizados para la determinacin de grupos funcionales. Como se efectan a travs de reacciones qumicas es un mtodo destructivo. La TLC es muy til para seguir el curso de una reaccin, detectar productos intermedios en reacciones, analizar productos crudos procedentes de mezclas desconocidas con el fin de determinar el nmero de componentes presentes. Tambin puede emplearse en trabajos de tipo preparativo, sembrando en forma de banda en lugar de hacerlo en un punto. Por otro lado, es muy usada como criterio de pureza o identidad negativo. Esto significa que si se visualiza slo una mancha en el cromatograma, no puede asegurarse que se trate de una sustancia pura, ya que con el sistema elegido (adsorbente y solvente de desarrollo) no es capaz de separar la sustancia de sus impurezas. Por otro lado si un patrn y una sustancia problema poseen el mismo Rf no puede asegurarse que los compuestos sean idnticos, mientras que si sus Rf son diferentes puede asegurarse que se trata de dos sustancias distintas. Una ventaja de utilizar TLC es que pueden ensayarse la separacin de varios solventes o mezclas de stos, a bajo costo y en tiempos relativamente cortos. Una vez que se hayan efectuado las pruebas correspondientes, se elegir el solvente ptimo de desarrollo, siendo aquel que logre un Rf de 0,5 para el componente nico, o que separe el mayor nmero de componentes de una mezcla. La cromatografa en capa fina es la tcnica auxiliar para la cromatografa en columna lquida.

Cromatografa en columna Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una
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buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin. Se introduce la muestra por la parte superior de la columna (Figura 3) y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. El xito de la separacin cromatogrfica depender del cuidado puesto en la preparacin de la columna y en el proceso de siembra y posterior elucin. a) El adsorbente debe estar ntimamente distribuido sin dejar canales de aire. Se puede colocar seco y aadir luego el solvente, pero este mtodo no siempre es eficaz, ya que suelen aparecer burbujas de aire en la columna, difciles de eliminar, y, adems, los adsorbentes aumentan de volumen al empaparse del solvente, rompiendo la columna. El mejor mtodo es formar una papilla con el adsorbente y el solvente de menor polaridad a utilizar, introducindolo en la columna y golpeando con una goma para compactar. La cantidad de adsorbente y el tamao de columna requeridos dependen del tipo de separacin que se tenga que efectuar. Generalmente se requieren 30-40 g de adsorbente por gramo de mezcla a separar. Tambin se debe tener en cuenta el tamao de la columna: una columna corta no proporcionar la longitud necesaria para conseguir una buena separacin. b) Una vez preparada la columna, la siembra se realiza disolviendo la muestra en el solvente de menor polaridad, si es soluble. En caso que sea insoluble se debe realizar una siembra seca, que consiste en disolver la muestra en un solvente en el que sea soluble y agregarle 2-4 veces el peso de adsorbente, eliminar el solvente, llevar a peso constante y sembrar. c) Una vez terminada la siembra, se comienza la elucin y separacin de diferentes fracciones, las que son chequeadas por TLC. Se renen las fracciones de acuerdo a su composicin. En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquido o un gas, y segn el caso se denominan respectivamente cromatografa lquida y cromatografa de gases. Esta fase mvil fluye a travs del relleno de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por la fase estacionaria. El flujo de la fase mvil se mantiene constante a travs de todo el proceso y as se logra

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que cada componente de la mezcla sea eludo de la columna como un componente puro, disuelto en la fase mvil (cromatografa de elucin). El problema principal de la cromatografa lquida clsica (columna) es la identificacin y cuantificacin de los componentes que eluyen de la columna, disueltos en la fase mvil. En general se usa alguna tcnica auxiliar, como por ejemplo, espectrofotometra, anlisis qumico, o simplemente un registro gravimtrico, para evaluar el contenido de cada uno de los componentes de la mezcla en las fracciones recolectadas. Se mencion anteriormente que la TLC tambin suele ser utilizada como tcnica auxiliar de la cromatografa en columna, no slo para analizar los eluatos (lquidos que eluyen de la columna) de la misma, sino tambin para hallar el/los solventes ptimos de desarrollo de la columna. Si la TLC y la columna estn confeccionadas con el mismo adsorbente, una de las diferencias es el tamao del material de relleno, dado que en la columna debe emplearse un grano ms grueso, perdiendo ligeramente poder de resolucin. Esto hace que al ensayar los solventes por TLC deban tenerse en cuenta ciertos puntos: Si en la TLC se obtuvieron valores de Rf entre 0,8-0,9 stos compuestos corrern con el frente del solvente en la columna. Mientras que si los valores de Rf son menores a 0,2-0,3 los compuestos quedarn en la lnea de siembra de la columna. Se aconsejar elegir como primer solvente de desarrollo de la columna aqul que haya logrado valores de Rf de los compuestos, entre 0,3 y 0,7; teniendo siempre una diferencia de Rf de no menos de 0,2 entre los dos componentes consecutivos. A medida que los compuestos vayan siendo eludos de la columna, podr cambiarse a otro solvente de polaridad ligeramente mayor, que tenga en TLC los mismos efectos que los descriptos recientemente. Haciendo un anlisis final de la cromatografa en columna clsica, es importante tener en cuenta ciertos parmetros de reproducibilidad, que son enunciados a continuacin: Adsorbente (granulometra, actividad) Solvente (calidad, secado, marca)
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Tcnica de elucin Relacin adsorbente/mezcla Flujo Volumen de fraccin Diferencias entre cromatografa plana y en columna: Aunque con algunas modificaciones, los principios tericos de la cromatografa en columna pueden ser aplicados, en general, a la cromatografa plana. Las diferencias entre estas tcnicas hay que buscarlas en la distinta configuracin de ambos sistemas cromatogrficos ya que la cromatografa plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que la cromatografa en columna es un sistema de lecho cerrado. Sobre esta base pueden indicarse las diferencias siguientes En la cromatografa plana la separacin se realiza por distancias mientras que en columna se hace por tiempos (o volmenes). En cromatografa plana la velocidad de la fase mvil solo puede controlarse indirectamente ya que est gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten el paso de dicha fase a travs del lecho cromatogrfico. Por el contrario, en cromatografa en columna la velocidad de la fase mvil puede controlarse fcilmente, dependiendo del gradiente de presin mantenido a travs de la columna. El tiempo que dura la separacin est determinado por el tiempo necesario para que el frente del disolvente llegue a una zona determinada del lecho cromatogrfico y es independiente del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografa en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que dura la separacin est determinado por el tiempo que tarda el componente ms lento en llegar al detector. En lo que se refiere a la forma de llevar a cabo el proceso de separacin, en cromatografa en columna la separacin de varias muestras, se realiza de forma secuencial, es decir, cada una de ellas debe someterse individualmente al mismo proceso de introduccin en la columna, separacin y deteccin, adems de proceder a reequilibrar la columna antes de introducir la siguiente
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muestra. En cromatografa plana por el contrario, la separacin de varias muestras se realiza de forma simultnea, siendo todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso separativo. Esto supone un ahorro de tiempo considerable ya que en cromatografa en columna la duracin de separacin de varias muestras ser la suma de los tiempos parciales necesarios para cada separacin individual. La eleccin de la fase mvil en cromatografa plana se realiza de forma que d la separacin requerida, no importando que algunos componentes de la muestra queden en el origen, ya que las placas se desechan despus de cada separacin. En cromatografa en columna, la fase mvil debe elegirse de forma que eluya todos los componentes de la muestra para que no se produzca el envenenamiento de la columna. Este envenenamiento puede suponer una prdida de tiempo considerable hasta que se logra eluir completamente aquellos componentes que hayan podido quedar acumulados al comienzo de la columna. Si es irreversible, el aspecto econmico puede ser de gran importancia. Otra diferencia bsica entre ambas tcnicas se encuentra en la forma de llevar a cabo la deteccin. Mientras que en cromatografa en columna es un proceso dinmico, pasando cada soluto eluido por el detector, en cromatografa plana es un proceso esttico. Esta diferencia da lugar a que la deteccin en la cromatografa plana sea ms difcil de automatizar que en columna, pero tambin, que sea un proceso ms flexible y variable. As, en lo que se refiere a los disolventes utilizados como fase mvil, la pureza o propiedades (absorbentes, cido base, etc.) de los mismos no son tan crticos como en columna, ya que estos se evaporan completamente entre el desarrollo y la medida. Por ejemplo, si en columna se utiliza un detector U.V., la fase mvil no debe contener disolventes o impurezas que absorban en esta zona del espectro, mientras que esto no supone un problema en cromatografa plana. Por otra parte, en esta tcnica, es posible aumentar la sensibilidad del proceso de deteccin mediante una seleccin adecuada de las reacciones utilizadas para mejorar la seal medida. El sistema de deteccin esttico permite, por

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ejemplo, registrar espectros de cada soluto por separado y seleccionar la longitud de onda de mxima respuesta de cada uno de ellos. En general, los solutos ms retenidos en cromatografa plana forman manchas compactas, por lo que se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos ms retenidos en la columna son los que dan picos ms anchos, menos resueltos y sensibles. CROMATOGRAFA DE PARTICION Las sustancias que componen la mezcla a separar, se reparten o distribuyen entre la fase mvil y la fase fija. Ya hemos definido anteriormente coeficiente de reparto o distribucin. La eficiencia de la separacin cromatogrfica es funcin de las diferencias entre los valores de los coeficientes de reparto de los diferentes solutos. Para separaciones rpidas conviene que los mismos tengan valores prximos a 1. Para cromatografa en fase gaseosa, el coeficiente de reparto del gas portador (fase mvil) es prcticamente nulo, ya que ste viaja en la columna sin disolverse en la fase estacionaria. Cromatografa en papel El fundamento de la cromatografa en papel no es estrictamente la adsorcin, sino ms bien una combinacin de adsorcin y reparto, en general, con predominancia de este ltimo fenmeno. El reparto ocurre entre el agua que hidrata la celulosa y la fase mvil orgnica. El papel se emplea fundamentalmente cuando se trata de separar compuestos polifuncionales o muy polares, por ejemplo, azcares y aminocidos. Tales productos no pueden ser cromatografiados en adsorbentes ms activos. El mtodo se usa como procedimiento analtico parecido a la TLC. La magnitud de la muestra a cromatografiar es de 5 a 300 g. La eleccin del solvente es muy importante, en la mayora de los casos el sistema de solventes debe tener agua. El desarrollo del cromatograma se consigue suspendiendo el papel de modo que su extremo inferior se introduzca en el solvente contenido en el recipiente (cromatografa ascendente sobre papel) o bien sumergiendo el extremo superior en un pequeo recipiente con solvente, haciendo que el movimiento

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del solvente ocurra por la suma de las fuerzas de la capilaridad y la gravedad (cromatografa descendente sobre papel). (Figura 4). Es muy importante que el desarrollo ocurra en una atmsfera saturada del solvente, de otra manera el solvente se evaporara del papel antes de ser reemplazado por la accin de capilaridad, y la separacin de los componentes no se lograra. Luego de terminado el desarrollo, se seala la posicin del frente del solvente y la tira de papel se seca. Se roca el papel con revelador y se calculan los valores de RF. Ventajas de la cromatografa en capa fina respecto de la cromatografa en papel (para la misma sustancia) el equilibrio (saturacin) de la cuba se logra rpidamente si se requiere se puede utilizar mayor temperatura para la elucin se pueden utilizar reveladores y reactivos agresivos se emplea como herramienta para la no-identificacin, con mayor frecuencia CROMATOGRAFIA DE GASES La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte (gas portador) y la distribucin de los componentes de una mezcla se logra mediante los procesos de adsorcin (cromatografa gas-slido) o particin (cromatografa gas-lquido). A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; sus nicas funciones son la de transportar el analito a travs de la columna y crear una matriz adecuada para el detector. Un esquema de un cromatgrafo gaseoso bsico, se muestra en la Figura 5. Los gases empleados como gas portador suelen ser He, N2, H2, Argn y CO2, ya que deben reunir ciertas condiciones: Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa Fcilmente disponible y puro Econmico
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Adecuado al detector a utilizar El empleo de esta tcnica puede extenderse a un amplio rango de sustancias para lo cual se puede variar la fase fija y la temperatura (puede llegar a los 500
o

C).

La muestra a cromatografiar puede ingresarse lquida (se vaporiza en el equipo antes de ingresar a la columna) o gaseosa. Por tanto la condicin esencial para utilizar la tcnica de CG es que los componentes de la mezcla sean vaporizables. Las columnas empleadas son tubos de vidrio o metal con una longitud de 1 a 200 m y dimetro de 0,1 a 50 mm. Las mismas estn dispuestas en forma de espiral y ubicadas dentro de un horno para permitir el control de temperatura de la separacin. Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica. El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. Funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes a travs de cromatogramas. Los detectores ms usados en CG son: detector de conductividad trmica, detector de ionizacin a la llama, detector de captura electrnica, detector de fotometra a la llama, detector de espectrometra de masas. La cromatografa de gases se utiliza para identificar y determinar el nmero de componentes de una mezcla. Su uso es de tipo analtico (el ms difundido) o preparativo.

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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN, O DE ALTA

RESOLUCIN (HPLC) La cromatografa lquida de alta presin utiliza un instrumental muy distinto (Figura 6) con ventajas significativas. En este mtodo se utilizan columnas de dimetro muy reducido (por ejemplo 2-5 mm), rellenas de materiales especiales pulverulentos, cuyas partculas tienen un dimetro promedio no mayor de 30-40 m. Este tipo de columna es muy eficaz, pero ofrece una gran resistencia al flujo de la fase mvil, o sea, una gran cada de presin. Por esta razn es necesario emplear sistemas de bombeo de alta presin (hasta 400 atm) que hagan fluir la fase mvil a una velocidad razonable a travs de la columna. La cantidad de fase estacionaria dentro de la columna es pequea, por lo que se requiere que la muestra tambin sea pequea, entre 1 y 10 mg. Si la presin de entrada a la columna no es muy elevada (100 atm o menos), la muestra se introduce en la cmara de inyeccin mediante una jeringa de alta presin. A presiones ms elevadas, se utilizan las vlvulas de inyeccin. Un detector, colocado a la salida de la columna, proporciona un registro continuo de la composicin del lquido que sale, lo que permite obtener cromatogramas como los de la Figura 7 (similar al de CG) y que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de la muestra. Otra ventaja de este mtodo es el escaso deterioro de la columna a pesar de su repetido uso, si bien en algunos casos es necesario regenerarla. Las ventajas mltiples de HPLC hacen de esta tcnica analtica una de las ms populares hoy da.

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FIGURAS

Figura 1. ESQUEMA DE UN EQUIPO PARA TLC

Figura 2- MODO DE DETERMINACIN DEL Rf EN UNA TLC


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Figura 3. COLUMNA CROMATOGRFICA

Figura 4. EQUIPO PARA CROMATOGRAFA EN PAPEL DESCENDENTE

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Figura 5. ESQUEMA DE UN CROMATOGRAFO DE GASES (CG)

Figura 6. ESQUEMA DE UN CROMATOGRAFO LQUIDO (HPLC)


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Figura 7. CROMATOGRAMAS EN CG Y HPLC

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CUESTIONARIO 1- Qu mtodos de separacin de mezclas conoce? 2- Defina el trmino cromatografa. 3- Cules son las bases de los distintos mtodos de cromatografa? 4- Defina cromatografa de adsorcin. Cul es la diferencia entre adsorcin y absorcin? 5- Nombre varios absorbentes comunes y ordnelos segn adsorcin creciente. 6- Que es una serie elutrpica? En qu se basa? 7- Ordene los siguientes solventes segn su poder de elucin creciente en silicagel: a) cloruro de metileno, cloroformo y tetracloruro de carbono. b) Metanol, 1-butanol, etanol y 1-propanol c) Agua, acetona, ciclohexano, cido actico, acetato de etilo, benceno, metanol. 8- Ordene segn su poder de elucin creciente los siguientes grupos funcionales: cidos carboxlicos, cetonas, aldehdos, alcoholes, hidroxicidos, cetocidos, alquenos, amidas, steres, teres, alcanos, hidrocarburos aromticos. 9- Cules son las ventajas de la cromatografa en columna sobre la recristalizacin? Cules son las desventajas? 10- Cmo se determina el solvente (o mezcla de solventes) de elucin en una columna?. Cmo se detecta que sustancia est presente en cada fraccin que se recoge de la columna?. De qu manera podra predecir en forma

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aproximada en que fraccin aparecer cada uno de los componentes de la mezcla? 11- Para que se usa una columna de cromatografa y para que una placa cromatogrfica? Puede emplearse la primera con fines analticos y la ltima con fines preparativos? En caso afirmativo, describa como procedera experimentalmente. 12- Qu es el soporte, el ligante y el adsorbente de una placa? 13- Qu es la relacin de frente (Rf)? De qu factores depende? Puede usarse como criterio de identificacin? 14- Se dispone de 2 solventes para disolver la sustancia A en cromatografa en capa delgada (CCD) Cul usara y por qu? Solvente Solub de A en mg/ml Pto ebull. 0C DMSO 18 180 Cl2CH2 10 41 Hexano 0.001 55 Agua 12 100

15- Si tiene una mezcla de acetona, Cl2CH2 y tolueno. Es posible realizar una cromatografa en placa delgada de los mismos con el objeto de separarlos? Por qu? 16- Qu es el revelado de una placa? Que es un revelador universal y uno especfico? Nombre por lo menos dos de cada clase. 17- Defina la cromatografa de particin. Si la cromatografa en papel es de particin: cules son las dos fases lquidas? 18- Qu tipo de sustancias se cromatografan en papel? Por qu no usa placa de slice o almina? 19.- Porqu debe saturar la cuba con el solvente a usar antes de una cromatografa en capa fina o papel?

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20- Sea una muestra lquida a la que se hace CCD con algunos testigos de Rf similar emplendose varios sistemas de solventes. Se revel con I2 y se obtuvieron los siguientes cromatogramas:

Cl4C

ter de petrleo

tolueno

tolueno-AcOEt (5:1)

M: muestra A B: patrones Cul de las siguientes opciones es correcta? a) La mezcla (M) es binaria. b) Tiene al menos 2 componentes. c) La mancha de menor Rf es B. d) La mancha de mayor Rf es A. e) No se puede afirmar nada de lo anterior 22. Si realiza una cromatografa en capa delgada de silicagel de una solucin clorofrmica que contiene los siguientes compuestos: C6H5COCH3 , CH3C6H4COOH y C6H5OCH2CH3 Se probaron 2 solventes de elusin A y B obtenindose: solvente A B Rf1 0.20 0.40 Rf2 0.35 0.70 Rf3 0.80 0.85

a) Asigne los compuestos a cada Rf. b) cul solvente es ms polar c) cmo revelara las placas cromatografiadas? Proponga 3 mtodos y aclare si son o no destructivos.

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23- Una cromatografa en capa delgada de slica gel desarrollada con diclorometano para una muestra en estudio dio dos manchas con los siguientes Rf: 0.02 y 0.35. Al modificar la polaridad del solvente con un 5% de metanol se obtuvieron cuatro manchas con Rf: 0.08, 0.25, 0.5, y 0.8. Con un 10% de metanol los Rf fueron: 0.2; 0,5; 0,85 y 0,95. a)- Disee el sistema que usara para purificar los cuatro componentes por columna preparativa. b)- Podra armar la columna con slica gel del mismo tamao de partcula que la que se usa para armar las capas finas? Qu inconveniente tendra? c)- Indique los pasos a seguir para obtener cada uno de los productos separados (armado de la columna, siembra, coleccin y anlisis de fracciones y reunin de las mismas). d)- Si la muestra problema no se solubiliza en el solvente de armado de la columna, cmo hace para realizar la siembra? 24- a) En que consiste la cromatografa gaseosa? b)- Qu detectores ms comunes puede citar en cromatografa gaseosa? 25- Que entiende por tiempo de retencin y volumen de retencin. Como vara el Tr con la temperatura de la columna, con el flujo de gas y con el nmero de carbonos de una serie homloga? 26- Si realiza una cromatografa gaseosa con fase fija no polar y N2 como gas portador, de una muestra lquida que contiene los siguientes compuestos: propanoato de metilo, hexanoato de metilo y 2,3-dimetilbutanoato de metilo: a) Cmo espera que sea el cromatograma? b) Cules sern los componentes ms difciles de separar? c) Si los componentes anteriores no pudieran resolverse en el sistema anterior, que variables modificara?

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27- Qu significa la sigla HPLC? Describa brevemente la tcnica. Por qu tiene tanta importancia en los estudios analticos actuales? Qu diferencia existe entre un detector de ndice de refraccin y uno de UV a lambda fija? 28- Conteste verdadero o falso y justifique brevemente: a) 30 mg de una mezcla de 2 azcares se pueden separar generalmente usando cromatografa en placa delgada de slica gel. b) 10 g de una mezcla de urea y benzoato de metilo de pueden separar usando cromatografia de adsorcin en columna. c) Para reconocer los componentes de una mezcla de alcoholes de C2, C3 y C4 se puede utilizar cromatografa gaseosa, aunque se disponga de 1 Kg de muestra. d) Una mezcla se puede considerar pura cuando luego de dos

recristalizaciones sucesivas el Rf en cromatografa en placa delgada es constante.

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