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INTRODUCCION La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos

contrapuestos. a) Retencin. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un soporte slido. b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas. El fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil, recibe el nombre de elucin. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionara, mientras que la mvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Tipos de cromatografa Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografa: a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la mvil un lquido. b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido anclado a un soporte slido. c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas. d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil un gas. Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre. a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas. c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil. Cromatografa en capa fina. La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase mvil, que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el frente del disolvente se encuentra prximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza. La relacin entre la distancia recorrida por un compuesto y por el disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor). Rf= Distancia recorrida por el compuesto/ Distancia recorrida por el disolvente La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo. La mayora de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que permite la visualizacin de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta, la visualizacin requiere utilizar un agente revelador. El revelador reacciona con los productos proporcionando productos coloreados. Cromatografa en columna. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de

vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase mvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los ms polares quedan ms retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retencin. El adsorbente ms utilizado para cromatografa de columna es gel de slice, aunque tambin se puede emplear almina y florisil. La elucin de la cromatografa puede realizarse por gravedad o mediante presin (Flash chromatography), la diferencia en ambos casos est en el tamao de las partculas de gel de slice (0,063-0,200 nm, slice de columna, 0,040-0,063 nm, slice flash). Debido a que la disminucin del tamao de las partculas de adsorbente conduce a una separacin ms eficaz, la cromatografa a media presin (flash) proporciona mejores resultados, adems de ser ms rpida. Las variables que ms influyen en la eficacia de la separacin en cromatografa de columna y utilizando gel de slice como adsorbente son las siguientes: a) Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La altura del adsorbente est relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El dimetro de la columna con la cantidad de producto a separar. b) Eleccin del disolvente. El disolvente tiene que conducir a una buena separacin de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizndose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elucin en gradiente. Una de las mezclas ms utilizadas es hexano/acetato de etilo.

OBJETIVOS Extraer los pigmentos de un producto natural asignado por el profesor haciendo uso de la tcnica ms adecuada Elegir mediante cromatografa en capa delgada el eluyente o mezcla de eluyente para separar los diferentes pigmentos de un producto natural por cromatografa en columna Verificar en cromatografa en capa delgada que se logr la separacin de los pigmentos en cromatografa en columna

HIPTESIS Si se selecciona un buen sistema de elucin a partir de la cromatografa en capa fina, por lo tanto se obtendrn los componentes vegetales (clorofila a y clorofila b) del pasto por medio de la cromatografa en columna.

VARIABLES Dependientes Independientes Adsorbente (seleccin adsorbente para el pasto) del mejor

Disolvente (sistema de elucin para el pasto) Sustancia a cromatografar MATERIAL Anillo metlico Mortero con pistilo Pipeta graduada 1/100 Gradilla Tubos de ensayo Embudo de separacin Probeta Soporte universal Pinzas de tres dedos Reactivos Arena Gel de slice Hexano Benceno Metanol Cloroformo Acetona Etanol ter etlico ter de petrleo Diclorometano

TCNICA Primeramente se determin el disolvente para el pasto, esto se realiz sometiendo pequeas cantidades de la muestra en los diferentes disolventes empleados, al obtener resultados conforme a lo anterior se pudo obtener el pigmento del pasto para que este fuera utilizado en cada placa de gelice. Se realizaron las cmaras con los diferentes aluyentes que se manejaron y as se someti placa por cmara, donde finalmente se observ la polaridad de cada eluyente , con base a esto se pudo realizar los posibles sistemas de elucin que se empleara en la cromatografa de columna. Obtenido el sistema de elucin adecuado se mont el sistema de cromatografa en columna donde obtuvo los compuestos vegetales del pasto.

Diagrama del procedimiento

Macerado

recoleccion de la muestra (pasto)

Evaluacion de los diferentes disolventes

cromatografia en capa fina

Preparacion de la camara de elucion

preparacion de las placas

obtencion del siistema de elucion

cromatografia en columna

montar el sistema de la C.C

Obtencion de los diferentes productos del pasto

ESQUEMAS DE LOS APARATOS UTILIZADOS EN LA CROMATOGRAFA

En el cuadro de arriba se observa cmo se llev acabo la cromatografa en capa fina, como primera parte de la prctica.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

La imagen muestra el procedimiento y montado del sistema de una cromatografa en columna

RESULTADOS

Eleccin de los disolventes

Maceracin del pasto

DISOLVENTES HEXANO BENCENO METANOL CLOROFORMO ACETONA ETANOL ETER ETILICO ETER DE PETROLEO DICLOROMETANO

SI LEVEMENTE SI MAYORMENTE NO EXTRAJO SI EXTRAJO SI EXTRAJO LEVEMENTE NO EXTRAJO NO EXTRAJO

RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

SISTEMAS DE ELUCION OBTENIDOS

ANALISIS Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS

En la tabla de los disolventes podemos darnos cuenta que muy pocos extrajeron el pigmento, donde se utiliz una proporcin de tres diferentes disolventes, para extraer el producto vegetal, donde posteriormente se someti a un lavado que posiblemente pudo haber alterado la polaridad, ya que fue en el nico momento en que se tuvo contacto con otras sustancias externas a las utilizadas para la elucion, pero ms adelante se explicara detalladamente. En la cromatografa de capa fina se determin el sistema de eluyentes en base a la polaridad del arrastre que tiene con el pigmento del pasto. Se utiliz como se muestra en las placascromatograficas el ter de petrleo siendo el menos polar, el ter etlico que podemos definirlo con un trmino medio de polaridad y finalmente el de mayor polaridad que fue cloroformo o acetato de etilo, donde claramente se observa que al cambiar este ltimo eluyente modifica gran parte del arrastre del compuesto vegetal, por lo tanto podemos decir que nuestro compuesto vegetal era muy polar. CONCLUSIONES

Se puede concluir que se llev a cabo parte de los objetivos ya que al observar lo sistemas de elucin obtenidos en la cromatografa de capa fina, nos podemos dar cuenta de que el sistema de elucin empleado es apolar, esto se debe a que los componentes de los pigmentos son polares Como se puede ver en los resultados de cromatografa en capa fina se puede aprecia el hecho de que los pigmentos se separan casi adecuadamente sin embargo no lo suficiente para que este sistema sea empleado en una cromatografa en columna, por ello al emplear los sistemas de elucin en la cromatografa en columna ningn pigmento se separa ptimamente .

BIBLIOGRFIA Abb David INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA, Espaa, Ahambra 1937 Hernandez V. INTRODUCCION A LAS TECNICAS CROMATOGRAFICAS, Mexico, UNAM Bequer F. CROMATOGRAFIA, princeles y tcnicas Mexico bb1975

CUESTIONARIO
1-A qu grupo de compuestos pertenecen los pigmentos? Carotenoides, Xantofilas, Clorofila a y b 2-A qu se deben que estos compuestos sean coloridos? -Carotenoides: son los responsables de la gran mayora de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en los alimentos vegetales Entre mayor sea la intensidad del color mayor ser el contenido de carotenoides -Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran prcticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las races, tallos, hojas y frutos a condicin de que estos rganos estn situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. -En los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenides. 3--Explique la diferencia entre cromatografa de adsorcin y particin. Cromatografa de particin La mayora de las sustancias tendrn distinta solubilidad en diferentes solventes. Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se mezclan entre s, se distribuir entre los dos solventes en relacin a su solubilidad en cada uno. Se llama efecto de particin a la distribucin de un soluto entre dos o ms solventes que no se mezclan. El solvente o el lquido que es atrapado por el medio del sostn sea este papel, gel, slice o almina, se llama fase estacionaria. Al solvente revelador se le llama fase mvil. Se puede obtener una fragmentacin completa si se permite al soluto entre las fases estacionaria y mvil.

Adsorcin La cromatografa de adsorcin o liquido-slido, es la forma clsica de cromatografa de lquidos. La adsorcin se lleva a cabo cuando hay una concentracin ms alta en la superficie de un slido que en la solucin circundante. La adsorcin se refiere al enlace de una sustancia a la superficie de otra. Generalmente los adsorbentes usados en cromatografa son el carbn mineral, el gel de slice, y la almina 4--Cules son las ventajas y desventajas de la cromatografa en capa fina en comparacin con la cromatografa en columna? Cromatografa en columna: Las separaciones en la cromatografa en columna pueden realizarse por reparto, adsorcin o intercambio inico. El estado fsico del adsorbente ha de ser de tal manera que permita el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de disolvente a travs de ella.

Cromatografa en capa fina Cromatografa en papel y electro cromatografa. En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de una materia que a la vez es el soporte o bien que recubre una superficie de vidrio, plstico o metlica. La fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por aplicacin de un potencial elctrico. En la actualidad la cromatografa en plano se centra en la tcnica de la capa fina, que es ms rpida, tiene mejor resolucin y es ms sensible que su alternativa en papel. 5-Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografa en capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad Columna: Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los ms generales la celulosa, gel de slice, almina oxido de magnesio, oxido de clcico y carbn activo (para separaciones por adsorcin y de intercambio inico). Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente Capa delgada: Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas Estos adsorbentes deber tener las siguientes caractersticas: Tamao de Partcula o Volumen de Poro o Dimetro de Poro o rea Superficial Homogeneidad Pureza 6-Hacer una lista de los eluyentes usados comnmente en cromatografa en columna y capa delgada en orden creciente de polaridad. En capa fina: ter de petrleo Tolueno Dietil-ter, t-butil-ter Diclorometano Acetato de etilo n-pentano, n-hexano Ciclohexano

Tetracloruro de carbono ter dietlico Cloroformo Acetona Iso-propanol Etanol Metanol cido actico 8-Como se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca? Se le aplica calor para as poder romperlo pero esto hace que n nos quede un orificio muy grande 9-Por que es necesario que la cmara de elusin este saturada con los vapores del eluyente? Porque as ser ms fcil el arrastre de los pigmentos 10-Explique cada uno de los siguientes trminos:

Eluyente: Un eluyente es un solvente que se usa en tcnicas de cromatografa para extraer un compuesto que se quiere separar de otra fase. Eluato: la sustancia que se separa o sale de la columna despus de cada extraccin. Eluccion fraccionada: Aparato de elucin fraccionada electrofortico tiene una columna con una rotacin conjunta de sello en el que un delgado chorro de elucin bfer es dirigido a travs de la luz de la columna electrofortica en una direccin perpendicular a la de migracin electrofortica. El contenido de la columna se gira en relacin con el jet estacionario o se gira el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear electroforesis en solucin libre o en columnas empaquetadas. Adsorcion: La adsorcin es un proceso donde un slido se utiliza para eliminar una sustancia soluble del agua. Es un proceso por el cual tomos, iones o molculas son atrapados o retenidos Particin: Elusin: se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte Adsorbente: es un slido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes lquidas o gaseosas. Se caracterizan por una alta superficie especfica y por su inercia qumica frente al medio en el que se van a utilizar. Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorcin depende de la concentracin de la sustancia en el agua, la temperatura y la polaridad de la sustancia.

14-Cundo es conveniente activar una placa y como se activa? Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que acta como una impureza y evita una buena separacin. La magnitud de calor depende del tipo de separacin que se requiere para compuestos hidrofilicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente adecuados, para los compuestos hidrofobicos o no polares es necesario un calentamiento ms intenso. 15-Qu espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D.? No tiene que ser espeso y No debe ser muy aguado, debe deslizarse solo por la placa. 18-Cmo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna? La polaridad del eluyente debe ser mayor 19-Cul es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografa en columna? En la cromatografa de columna las molculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las molculas por la fase estacionaria o por la fase mvil. Si una molcula A tiene ms afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajar ms rpido que A. ter de petrleo. ter dietlico. Ciclohexano. Acetato de etilo. Tetracloruro de carbono.* Piridina. Benceno.* Etanol. Cloroformo.* Metanol. Diclorometano. Agua. cido actico. 20-A qu se le llama frente del eluyente en cromatografa en capa delgada? (a) = Distancia del punto de aplicacin a la mancha. (b) = Distancia del punto de aplicacin al frente del eluyente 21-Cmo se controla la salida de los componentes en una cromatografa en columna? Se controla con la llave de la bureta se va colocando los distintos pigmentos en tubos de ensaye.