Desgrabaciones. Bioquímica. ADN.

El ADN es un polímero lineal (estructura primaria del ADN) de cuatro

desoxiribonucleotidos: desoxiadenilato (A), timinilato, guanilato, citidilato. Cada nombre
está representado con una letra.
Todas las formas de vida presente en la tierra utilizan a los ácidos nucleídos para
almacenar información genética.

Componentes del ADN: una base, un azúcar y un grupo fosfato (nucleótido).

Nucleósidos: cuando tenemos presente solo la base y el azúcar.

Nucleótido: cuando tenemos presente la base, el azúcar y el grupo fosfato.

Las bases nitrogenadas.

Tenemos dos tipos de bases:
 Las purinas: adenina, guanina.
 Las pirimidinas: citocina, timina, uracilo.

Dos diferencias básicas entre el ARN y ADN.

En cuanto al azúcar. El ARN es una D-ribosa y el ADN es una 2´-desoxi D-ribosa (carece
de un grupo OH en el carbono 2).

Recordar: casi todas las especies vivas utilizan ADN para conservar su material genético;
¿Por qué no ARN? Muchos virus utilizan ARN para conservar su material genético.

Otra diferencia es del tipo de pirimidina presente. En el ADN tenemos timina; pero en el
ARN tenemos uracilo.

Otras consideraciones básicas.

Tenemos el nucleósido o nucleótidos que pueden ser mono, di, o trifosfatados.
La diferencia entre ambos es la ausencia o presencia del grupo fosfato.
Importante la nomenclatura que está en las láminas.

Como se forma ese ADN.

Recordar que el ADN es un polinucleótido, es decir, que tiene varios nucleótidos.
En las laminas tenemos dos nucleótidos, entonces entre ellos se forma un enlace tipo éster
también llamado enlace fosfodiéster. De esta manera es que forma el ADN, varios
nucleótidos se unen mediante el enlace fosfodiéster.
Entonces cuando se forma el polinucleótido que se unen las unidades de nucleótidos
vamos a tener un extremo 5´-fosfato libre y tenemos un extremo 3´-hidroxilo libre (porque
no está unido a más nada, considerando solo los dos nucleótidos que se están uniendo;
recordar que pueden ser más nucleótidos).
En enlace fosfodiéster ocurre entre el extremo 3´libre de un nucleótido y el extremo 5´libre
de otro nucleótido, de esta manera se forma.
Otro enlace importante en esta molécula es el enlace n-glucosídico que es el que está entre
la base y la desoxiribosa (en este caso porque estamos hablando de ADN). Ese nombre de
glucosídico proviene de glucosa, es decir, del azúcar.

La estructura primaria podemos simplificarla cuando hablamos del ADN, en la base

colocamos la letra de lo que contiene.
Recordar cuando tenga uracilo entonces tengo ribosa y cuando tenga timina entonces
tengo desoxiribosa.
La P es el fosfato.

El ADN también tiene su estructura secundaria, aquí llegamos porque se descubrió que la
adenina formaba un puente de hidrogeno con la timina y que la guanocina formaba un
puente de hidrogeno con la citosina. También se descubrió que esa composición de bases
variaba de una especie a otra.
Entonces en la primera investigación ya se sabía que se tenía cuatro nucleótidos y que
además formaban pares A-T y G-C pero con la segunda investigación (Watson y Crick) se
descubrió que la manera en que se disponía era en doble cadena en forma de hélice o
helicoidal; y además que había una separación especifica entre una base y otra. Entonces la
importancia del trabajo de Watson y Crick es que ellos descubrieron que las bases estaban
hacia el interior, las cadenas de ribosa y de fosfato están hacia los extremos. Lo segundo
importante del trabajo de estos dos hombres es que ellos se dieron cuenta que esas cadenas
corrían de forma antiparalela (una cadena tiene en su extremo superior el 5´ y en su
extremo inferior el 3´, la otra cadena que es la coplementaria tiene su extremo superior el 3
´ y en su extremo inferior el 5´), van en diferentes direcciones.

Chargaff llego a la conclusión de cómo se apilaba una base con la otra. El dijo que la
cantidad de adenina era igual a la cantidad de timina (A=T), y que la cantidad de guanina
era igual a la cantidad de citocina (G=C). También dijo que la cantidad de bases variaba de
una especie a otra.

En el esqueleto ribosa fosfato podemos observar la unión de las bases. Vemos que G-C
forman tres puentes de hidrogeno, y A-T forman dos puentes de hidrogeno. La estructura
está estabilizada por las fuerzas de apilamiento entre las bases y por enlaces tipo puentes
de hidrogeno entre ellas. Estas fuerzas de apilamiento son porque una base está sobre otra,
aunque estas no forman ningún enlace como tal (no hay enlace covalente) y a su vez
tenemos el enlace de puente de hidrogeno con la base complementaria.
Recordar que tenemos unas bases hacia el interior que son apolares. Cuando vemos una
base sobre otra esas son las fuerzas de apilamiento y lo que une una cadena con otra son
los puentes de hidrogeno. Entonces para que una base se aparee con otra se necesita los
puentes de hidrogeno y es lo que permite que las bases sean complementarias (A=T y
G=C). Y la fuerza de atracción de una base con respecto a la otra es la fuerza de
apilamiento de tipo apolar.

Factores que estabilizan la doble hélice.

La nucleobase tienen menor contacto con el agua igual hacia el interno: los enlaces de
puentes de hidrogeno que es lo que me da la complementariedad de las bases y las fuerzas
hidrofóbicas de van der walds o fuerzas de apilamiento entre una base y otra.
Y el esqueleto ribosa fosfato está en contacto con el agua y va hacia la parte externa.

Eje de la doble hélice.

La doble hélice tiene una particularidad y es que ella es dextrógira, es decir, gira hacia la
derecha; además ella tiene un punto mayor y un punto menor. Los pares de bases están
ubicados de manera perpendicular al eje de la doble hélice.

Topología del ADN.

El ADN es una molécula muy grande. ¿Cómo hacemos para que el ADN entre dentro de
los caracteres? Este debe compactarse.
Hay algo a lo que se le llama enrollamiento, es cuando vemos el ADN con su doble hélice,
esta enrollada de manera normal.
Hay algo a lo que se le llama el súper enrollamiento, y cuando esta súper enrollada es
cuando nos permite compactar ese ADN.

Si el ADN esta enrollada tenemos la estructura secundaria (relajada). Súper enrollada

entonces esta compactada. Y si esta desenrollada entonces tenemos la estructura
primaria.

Cuando el ADN esta desenrollado nos sirve para replicarla (si esta compactado no se
puede replicar).

Recordar: la estructura primaria vemos la desoxiribosa, el grupo fosfato y la base. La

estructura secundaria tendrá lo mismo pero veremos las dos cadenas antiparalelas.
Si está súper enrollado será con la estructura secundaria.

Hay unas enzimas que se les llama topoisomerasas, estas rompen la hélice y logran
desenrollar el ADN (desenrolla una vuelta). En el ejemplo vemos una cadena que esta
enrollada, viene la topoisomerasa y rompe en algún lado de la cadena y una de esas hebras
del ADN se desenrolla y entonces se llega a una estructura del ADN que esta enrollada
pero con una vuelta menos.
Las topoisomerasas son importantes en el proceso de replicación. Además son un blanco
farmacológico para el tratamiento de infecciones bacterianas y el cáncer.

Cuando el ADN logra enrollarse, súper enrollarse y compactarse entonces logra entrar en
la célula. Por otro lado sabemos que tenemos 23 pares de cromosomas y la manera que
entre entonces allí en nuestra célula es que se compacte. ¿Cómo se compacta? Formando lo
que se llama nucleosoma, hay unas moléculas bien importantes a las que se les denomina
histonas, estas permiten que el ADN vaya compactándose. Entonces a la combinación de
ADN más histonas se le denominan nucleosoma.
Nucleosoma: es la unidad fundamental de la cromatina. Las histonas son como 8
subunidades que se juntan y forman un octamero.

NOTA: el ADN debe estar compactado en forma de cromosoma para que entre en la
célula. Para que el ADN se replique debe estar desenrollado.
Desenrollado es la estructura primaria. Enrollado es la estructura secundaria.

Ejercicio: en cuanto a la ley de chargasff (este fue quien determino que la cantidad de A=T
y G=C).
Determine los porcentajes de cada base en un ADN que contiene 20% de T.
Respuesta: si tengo 20% de T entonces tengo 20% de A, la suma de eso da 40%; el resto
sería el 60% de G y C, entonces tendremos 30% de G y 30% de C.

Otra pregunta: Una hebra sencilla de ARN que contiene 20% de uracilo.
Hasta ahora hemos visto que el ADN tiene una estructura primaria y una estructura
secundaria que tiene una hélice y tiene dos hebras antiparalelas. Pero el ARN es una
cadena sencilla. Más adelante vamos a ver que el ARN forma alguna complementariedad
en algunos sitios y eso le da una estructura secundaria pero no son como las del ADN.
Entonces como el ARN es una hebra sencilla no tiene complementariedad. Entonces la
pregunta es ¿qué se puede pronosticar con el porcentaje de las demás bases? Desde la
estructura primaria no se puede saber el porcentaje de las demás bases, almenos que
hagamos estudios de laboratorio para determinar esa proporción.
Como conclusión entonces el ARN no tiene cadena complementaria, ella se puede plegar
en alguna zona para formar otros tipos de estructuras que no son tipo hélice.

Tenemos el ADN que luego de la transcripción, esa información llega al ARN y luego de la
traducción es que llegamos a la formación de las proteínas.
El ADN es más estable que el ARN.
La información genética va de ADN a ARN y a proteínas. En los virus es de ARN a ADN;
a esto se le llama el dogma central de la biología molecular.

Replicación del ADN.

El ADN almacena la información que determina la secuencia del ARN que en
consecuencia determina la estructura de las proteínas.
El emparejamiento especifico que hemos postulado sugiere inmediatamente un
mecanismo de copia para el material genética: Watson y Crick.

Una característica de la replicación:

La replicación es de tipo semiconservativa, es decir, que tenemos una cadena patrón (ADN
madre), esa cadena se separa y de cada molde se saca el ADN hijo. Entonces tenemos el
ADN madre se divide en dos (hebras nuevas de ADN) y cada cadena por su lado es
replicada, eso es lo que quiere decir semiconservativa. Debe existir un molde para que esa
información pueda copiarse. La nueva cadena se ensambla sobre un molde preexistente.

¿Cómo se llama las enzimas que catalizan la adición de esos nucleótidos?

Se llama ADN polimerasa, es la que une un nucleótido con otro formando un enlace
fosfodiéster.

Proceso de replicación.
Debemos tener un ADN molde, que es una de las dos cadenas que está separada (nota: la
otra cadena también se copia). Pero antes de que actúe una polimerasa, actuará una
primasa. Esta primasa sintetiza un fragmento corto sobre el molde o mejor dicho
complementario a mi molde que va ser de tipo ARN (uracilo-uracilo).
La primasa actúa primero porque la polimerasa no puede actuar si no existe un extremo 3
´-hidroxilo libre. (Recordar que la formación del enlace fosfodiester ocurre cuando hay un
extremo 3´-hidroxilo libre para formar ese enlace). Entonces la polimerasa necesita que
haya ese extremo 3´-hidroxilo libre que se lo va a dar ese fragmento corto.
Entonces cuando tenemos el molde actúa primero la primasa y luego actúa la polimerasa.
Ya sabemos que en el ADN no tenemos uracilo, entonces posteriormente todo ese uracilo
va a ser removido (se explica más adelante).

La ADN polimerasa sintetiza en el ADN siempre en dirección 5´3´.

Otro ejemplo: tenemos la hebra molde, vemos de un lado el extremo 3´-hidroxilo libre (que
lo coloco la primasa) a ese segmento se le llama sebador (se le llama sebador o hebra
sebadora a ese segmento corto de ARN, que no es toda la hebra, solo ese segmento corto).
Las ADN polimerasa requieren de un sebador.
Las ADN polimerasa catalizan la formación del enlace fosfodiester y voy a necesitar de
los cuatro nucleótidos para que se me pueda dar la reacción.

Entonces la síntesis ocurre siempre en dirección 5´3´, pero recordamos que el ADN tiene
dos cadenas y que son antiparalelas. ¿Entonces como hace la polimerasa para no perder su
objetivo y sintetizar el ADN y ponerlo en la dirección en la que ella va?
Vamos a tener una hebra conductora: esta hebra es la que se me sintetiza en el sentido de
la polimerasa (5´3´). Tenemos una hebra retardada: que es la hebra que tiene su molde en
la dirección opuesta al otro molde, es la que se sintetiza en el otro sentido. Lo que se
sintetiza en la hebra retardada se le llama fragmentos de okazaki (se ha determinado que
son más o menos mil nucleótidos cada fragmento).
Tenemos una horquilla de replicación que es donde ocurre la replicación del ADN, ese
nombre viene dado porque tenemos que recordar que el ADN es una hélice, que hablamos
de las topoisomerasas y que necesitábamos que el ADN estuviera desenrollado y es allí
donde ocurrirá la replicación, entonces donde esta ocurrieron esa replicación el ADN está
separado y a eso se le denomina horquilla de replicación.

Tenemos varias enzimas: la helicasa que ayuda a desenrollar ese ADN doble o parental;
esas proteínas de unión al ADN monocatenarios, es decir, se une a cada hebra por
separado, estabilizan la hebra molde del ADN.
Para tener en claro, tenemos un ADN enrollado, entonces si desenrollo un pedazo, los
otros extremos estarán un poco colapsados (se súper enrollan). Entonces si está ocurriendo
la replicación en la horquilla, tenemos el ADN polimerasa pero necesitamos a alguien que
mantenga esas cadenas separadas, porque el ADN va a tender a unirse otra vez, entonces
necesitamos a alguien que mantenga separadas esas cadenas para que la polimerasa pueda
actuar, entonces allí tendremos esas proteínas de unión al ADN monocatenarios.
Tenemos las topoisomerasas (ya las vimos) que permite la rotación libre de las cadenas de
ADN, ellas ayudan a que no ocurra un colapso topológico (tiene que ver con la forma y
con el súper enrollamiento, es decir, si estamos desenrollando algo de un lado, lo otro
aunque no estará totalmente abierto debe permitir que el ADN no pierda su forma).
Las ligasas unen los fragmentos de ADN.

En un ejemplo vemos: la horquilla de replicación el ADN abierto, tenemos las helicasas

(proteínas de unión al ADN monocatenario que mantienen el ADN abierto) y tenemos la
hebra conductora y la hebra tardía.
La hebra conductora: es la hebra que se mueve en sentido de la horquilla de replicación.
Otro esquema: tenemos la horquilla de replicación y una topoisomerasa que va
desenrollando las cadenas, tenemos una pimasa que va colocando el sebador para que se
vayan formando los fragmentos de okasaki; tenemos la ligasa que va uniendo los
fragmentos de okasaki.
Tenemos la hebra continua o conductora y la cadena debe plegarse para dejar que la
polimerasa pueda actuar en la dirección 5´3´, deja el fragmento de okasaki allí y continúa.

Hay un origen de replicación, es el lugar donde comienza la replicación (llamado ori), es

un sitio específico de unión para proteínas que inician el proceso de replicación.
Este sitio ori se determina porque hay unas proteínas que son las dan el indicio de que el
sitio ori esta allí; también se denomina complejo multiproteico o RC que es donde están
esas proteínas.
Entonces tendremos en todo el ADN algún sitio en donde tendremos entre 100 y 300 pares
de bases en donde se le van a ubicar esas proteínas que son las que indican que allí se
encuentra ese sitio ori.

Tenemos como ejemplo el ADN de la E. Coli que es circular; este ADN tiene un solo ori.
De igual manera se le van a sintetizar los sebadores, vamos a tener la helicasa las proteínas
de unión del ADN monocatenario que va a mantener separado las hebras, luego viene la
polimerasa y replicara todo el ADN.

El genoma humano necesita múltiples ori (por lo largo que es), es decir, múltiples sitios de
inicio de la replicación.

Las polimerasas tienen una actividad exonuclear, es decir que eliminará el ARN sebador,
esto lo hace cuando actúa en sentido 5´3´ (elimina el sebador) porque el ADN una vez que
se haya terminado de replicar solo debe contener en su molécula A, T, G, C.
La misma polimerasa puede actuar en sentido 5´3´ eliminando el apareamiento de bases
incorrectas, esto es algo que puede ocurrir en el momento de la replicación.

Se dice que la actividad de las polimerasas es eficiente y que prácticamente no cometen

errores, esto es porque cuando está ocurriendo la replicación tendremos la cadena molde,
entonces la polimerasa cuando va pasando hay una selección entre la base que es correcta.
Otra cosa que ocurre es que hay una formación de puentes de hidrogeno (estructura
secundaria) que es la que permite la complementariedad de bases, entonces hay una
selección de la base correcta y esa base será a fin a su complemento, esto viene dado por la
formación de los puentes de hidrogeno. ¿Por qué la ley de chargaff se cumple? Recordar
que hay purinas y pirimidinas, las purinas tienen un anillo doble y las pirimidinas tienen
un solo anillo. Entonces si unimos dos purinas tendremos una estructura muy grande y si
unimos dos pirimidinas tendremos una estructura muy pequeña, todo esto no va a
permitir que el ADN tenga su estructura secundaria.
Recordar que tenemos los fragmentos de okasaki que se forman en la cadena retardada
entonces, en el ejemplo veíamos el ARN sebador, luego actúa la polimerasa con su
actividad exonucleasa y luego viene el relleno de ese espacio. Finalmente actúa la ligasa
que es la que une esos fragmentos de ADN.
Repaso de la Replicación.
Recordar que teníamos una hebra conductora y una retardada. En la retardada era donde
sintetizaba la cadena de ADN en forma de fragmentos de okasaki. En el extremo 3´
tenemos un hidroxilo. En el extremo 5´ tenemos un grupo fosfato. La que hace la reacción
de adición o unión de nucleótidos es la polimerasa. La polimerasa ella lee el molde en
dirección 3´ 5´ pero sintetiza (polimerisa) en dirección 5´3´. Recordar que la polimerasa
siempre lee y sintetiza en el mismo sentido aun cuando las cadenas sean antiparalelas.

La ADN polimerasa en general es la que sintetiza el ADN a partir de un molde

preexistente.
En las láminas vemos en una célula procariota una polimerasa 1 que elimina el sebador y
deja un hueco, polimerasa 2 repara el ADN, polimerasa 3 es la polimerasa principal de la
síntesis del ADN.
Hay una polimerasa 1 y una polimerasa 3. La polimerasa 3 es la polimerasa principal que
es la que sintetiza el ADN. La polimerasa 1 es la que elimina el sebador y se encuentra en
los fragmentos de okasaki. La más rápida es la polimerasa 3.
En las células eucariotas, pasa que la alfa se parece a la polimerasa 1 y además tiene la
primasa. La delta es la enzima principal en el caso de la alfa hélice. (No enrollarse con
estos tipos de polimerasa, lo importante es la ADN polimerasa de manera general. Las
demás es para saber cómo conocimiento general).
La polimerasa 2 es propensa a introducir errores; cuando el ADN está dañado ni la
polimerasa 1, polimerasa 3 ni la alfa ni la beta van a poder sintetizar el ADN, entonces la
polimerasa 2 propensa a introducir errores es la que permite terminar la síntesis.

Recordar la cadena continua se sintetiza en la misma dirección en la que se mueve la

horquilla de replicación y la cadena retardada se sintetiza en dirección opuesta, ¿cómo se
hace? Se forma como un plegamiento para que las dos cadenas puedan ir a la par. La
síntesis de la cadena continúa y retardada ocurren de manera altamente coordinada.

¿Dónde se inicia la replicación?

Hay un sitio al que se le llama “ori”. ¿Qué hay en ese sitio? Algo especifico en donde se
unen unas proteínas (complejo de proteínas ORC) que determinan que ese es el sitio ori.
Ese sitio del ADN está constituido por almenos entre 100 y 300 pares de bases.

El ADN del E. Coli es circular a diferencia del ADN en humanos que es lineal. En la E. Coli
que es un organismo muy pequeño tenemos un solo sitio ori, es decir, un solo sitio donde
se inicia la replicación. Pero en los humanos tenemos varios sitios ori, es decir, varios sitios
donde se inicia la replicación, esto es porque el genoma en este caso es muy grande, y si
no, no habría manera de terminar la replicación en un tiempo prudencial. En los humanos
entonces también habrá varias horquillas de replicación moviéndose en un sentido a otro
hasta que se replica todo el ADN.
Las polimerasas también tienen actividad exonucleasa, que van a ser una reparación en el
sitio, actúan en dirección 5´3´ eliminando el ARN sebador; aquí estaríamos hablando de
una polimerasa tipo 1 o tipo alfa porque me está eliminando el ARN sebador; actúa en
dirección 3´5´ eliminando el apareamiento de bases incorrectas.

Para terminar de entender lo que ocurre en la cadena retardada, recordar que teníamos
unos fragmentos de okasaki y luego teníamos lo que es la eliminación del ARN sebador
con la actividad exonucleasa 5´3´; entonces ese ARN se me elimina y se rellana con ADN y
luego viene la ligasa y une allí.

Fidelidad de la replicación.
La exactitud de la replicación del ADN es crítica para la reproducción celular.
¿Cuántos errores se introducen cada vez que se copia el ADN? ± una base incorrecta por
cada 109 o 1010 nucleótidos.
¿Cómo la ADN polimerasa ayuda a seleccionar la base correcta?
Hay una geometría que permite que las bases se apareen de manera correcta en el sitio
activo: tenemos que la A se aparea siempre con T y que G se parea con C. entonces si por
ejemplo se unen dos pirimidinas seria muy pequeña esa molécula y si se unen dos purinas
serian muy grandes las moléculas; también influye los puentes de hidrogeno que se
forman entre las bases, entonces a medida que pasa la polimerasa se forman esos puentes
de hidrogeno y se va seleccionando la base correcta.
Las bases pueden tautomerizarse. (preguntar esto, no se entiende)

Conclusión de la síntesis del ADN.

Tenemos las tres etapas:
 Inicio: reconocimiento del sitio de inicio, aquí hablamos de los sitios ori, también
hablamos de la separación de las cadenas y síntesis de los sebadores.
 Elongación: formación de la cadena continua, y los fragmentos de okasaki en la
cadena retardada.
 Terminación: tenemos la degradación de los sebadores, y la unión de los
fragmentos de okasaki.

Mutaciones.
Las mutaciones genéticas pueden ocurrir por dos factores:
 Por agentes externos.
 En el momento de la replicación.
Hay mecanismos de reparación del ADN, estos mecanismos de reparación pueden ser:
 En el momento de la replicación.
  Intervención directa a la agresión química (responsable del daño).
 Eliminación de las bases dañadas. (en este paso de eliminación de las bases
dañadas, lo que se hace es reponerse con nuevo ADN).
Como ya se dijo, en el momento de la replicación, la polimerasa puede detectar cuando
una base incorrecta se ha añadido, entonces la elimina y coloca la correcta.
Recordamos que en el ADN tendremos una base sobre otra, entonces al aplicar la luz U.V
provocara que las bases formen, o esa estructura se una formando un anillo ciclobutano.
En eucariotas hay un mecanismo de reparación que se denomina fotoreactivacion,
entonces la energía de la luz visible puede romper ese anillo ciclobutano y entonces se
corrige esa mutación. (Preguntar bien este proceso de la luz U.V)

Otra cosa que puede ocurrir en el ADN es la oxidación de las bases, en este caso ocurre
específicamente con la guanina; como ya sabemos guanina se aparea con citocina pero en
el momento en que la guanina se oxida se forma oxidoxiguanina (buscar bien el nombre),
entonces esa guanina oxidada puede aparearse con la adenina y eso genera un problema
en el ADN porque se está insertando una base que no es correcta.

Otra cosa que puede ocurrir es una Desaminación, vemos en las laminas el anillo de
citocina y pierde el amino entonces se transforma en uracilo.

Otra cosa que puede ocurrir es una Depurinación, es decir que se elimina la purina.
Vemos en las laminas una purina unida a la desoxiribosa y luego de la depurinación no
tenemos la purina, entonces es como un ADN hueco, es decir, tenemos el esqueleto de
ribosa fosfato pero no tenemos la base.

Mecanismo de reparación del ADN.

Los que ya vimos anteriormente, además de:
 Escisión de bases y escisión de nucleótidos, esto es cuando el ADN está dañado por
las bases incorrectas de ADN, o por los problemas que ya vimos como
desaminacion, etc. por ejemplo: tenemos un ADN que tiene uracilo (sabemos que el
uracilo no forma parte del ADN), entonces hay que quitarlo de allí, para eso viene
la ADN glucosilasa; esta ADN glucosilasa rompe el enlace n-glucosidico, cuando
esto ocurre me quedo sin base (queda un sitio apurinico o apiriminico, es decir que
no tiene nada) solo el esqueleto ribosa fosfato; luego viene la endonucleasa que
corta ese esqueleto de ribosa fosfato y luego viene la desoxiribosafosfodiesterasa,
esta última es una enzima; luego de que actúa viene la polimerasa y la ligasa, y se
coloca en lugar de uracilo a la citocina que es la que le corresponde en el lugar.

Endonucleasa: solamente corta ese esqueleto de ribosa fosfato (separa mas no elimina
nada).
Desoxiribosafosfodiesterasa: sinde la parte de ribosa y fosfato que pertenecía a la base
(esta si elimina la ribosa y el grupo fosfato).
Después de estas dos actúa entonces la polimerasa y la ligasa.

Cuando hablamos de la escisión de bases es porque se va a eliminar una base, pero en la

escisión de nucleótidos se eliminara un grupo de nucleótidos.
Como ejemplo de esta ultima: un rayo UV actuó sobre el ADN y se formo un dímero de
timina (recordar el anillo de ciclobutano) dos timinas unidas por un enlace covalente.
Entonces viene una nucleasa y encuentra que hay un daño, pero no puede eliminar un
solo nucleótido, sino que ella corta una sesión de más o menos 12 nucleótidos, entonces
sale de allí y luego es que puede actuar la polimerasa que va poniendo el esqueleto y la
ligasa para unir todo lo que son los fragmentos nuevos.
Entonces vemos que en este caso tenemos tres enzimas la nucleasa, polimerasa y la ligasa.

 Reparación de emparejamientos incorrectos: estos emparejamientos incorrectos se

refiere por ejemplo cuando se une una timina con una guanina o una adenina con
una citocina. entonces en las láminas tenemos un molde con grupos metilos que
nos permitirán corregir, dependiendo de donde se ubiquen esos grupos metilos,
cual es la base que no va en ese emparejamiento. Vamos a tener unas enzimas
denominadas MUCL, MUCE (buscar bien los nombres), y también unas llamadas
MUTA estas últimas, reconocen el grupo metilo y dicen cual es la cadena que es
correcta. Ahora el emparejamiento incorrecto lo detecta las MUCL y MUCE y luego
viene la nucleasa y rompe un segmento grande y luego viene la polimerasa y la
ligasa.

Relación que hay entre la bioquímica y la biología molecular.

Se puede decir que es casi lo mismo porque la biología molécula estudia todo lo que es el
ADN, como ocurre todo ese proceso de replicación y cuando quieren estudiar la parte de
genética.
Biología molecular: Estudio de los mecanismo de transcripción y expresión de la
información genética que determina la estructura y función celular.

PCR
Lo que permite es obtener una reacción en cadena de la ADN polimerasa, se utiliza mucho
en el laboratorio, y su fin es un segmento de ADN, replicarlo muchas veces para luego
poder estudiarlo, esto es porque si yo tengo una secuencia que quiero estudiar de ADN
pero es muy poca, entonces no será posible poderla estudiar, es decir, cuando la coloque
en los equipos de estudio no se podrá saber todo lo que esa hebra contiene (composición).

En las láminas vemos un tubito de ensayo, entonces lo que necesitamos es un molde de

ADN, unos primers u oligonucleótidos ¿para qué sirven los prider?; la ADN polimerasa
que es la que me va a hacer la replicación, unos cofactores, nucleótidos, desoxinucleótidos,
difosfatos y un equipo que se llama demociclador (revisar bien esa palabra), y es este
equipo es el que me perite ampliar esa secuencia de ADN.
NOTA: el primers o sebador sirve para tener ese extremo 3`-hidroxilo libre para que así pueda
actuar la polimerasa.
¿Cómo vamos a amplificar ese segmento de ADN?
Recordar primero estos conceptos:
Hibridación: en donde se unen las hebras (las cadenas se unen).
Desnaturalización: proceso por el cual se aplica calor y las hebras se separan.
La idea es que se desnaturaliza la ADN patrón.
Vemos un grafico de temperatura versus tiempo, entonces al aplicar calor ¿se
desnaturaliza o se hibridiza el ADN? Se desnaturaliza.
Entonces aplicamos calor y eso ocasiona que se abran las cadenas, luego bajamos la
temperatura, y como las cadenas ya están separadas entonces los primers se colocan en
donde deben ser, en su parte complementaria de ese ADN patrón, entonces hasta aquí
tenemos dos cadenas de ADN que están separadas y además tenemos los primers ya
alineados; y luego comienza la etapa de síntesis a una temperatura más alta.
¿Qué tipo de polimerasa podemos colocar allí, ya que estamos hablando de 90ºC?
Recordar que todo eso lo tenemos en el laboratorio en un frasquito, entonces si vamos a
colocar una temperatura de 90ºC, y la polimerasa la vamos a colocar al inicio, entonces
¿Cómo debe ser esa polimerasa? ¿Podrá ser la polimerasa que tenemos en el cuerpo
humano? NO, porque sabemos que tenemos una condición proteica y si le colocamos calor
se desnaturaliza; entonces en este caso tenemos una polimerasa que tiene un nombre
específico y se llama la TAPpolimerasa.
Esta TAPpolimerasa es termoestable y me permite soportar esos ciclos de alta
temperatura.
Entonces es esa TAPpolimerasa la que se coloca en el tubo de ensayo al inicio, ya que es
termoestable y soportara una temperatura de 90ºC (y no la polimerasa del cuerpo
humano).
Entonces tendremos la etapa de desnaturalización, luego se colocan los primers en donde
deben estar, y luego la TAPpolimerasa hace su trabajo de síntesis.

Buscar las fases del ciclo celular, para saber donde ocurre la síntesis del ADN, en un sistema
biológico.
Entonces este ciclo queda hasta aquí, es solo un ciclo donde se abren cadenas, se alinean
los primers y luego viene la TAPpolimerasa y ejerce su función de extensión de ADN.
¿Qué tengo como resultado?
Dijimos al inicio que teníamos un patrón que tiene dos cadenas, es decir, dos patrones, lo
que le sucede a esa cadena es un solo ciclo de replicación, había una sola desnaturalización
a 90ºC, vimos que se alineaban los primers y luego vino la síntesis de ADN; todo esto es
un ciclo. Entonces en cada nuevo ciclo el nuevo ADN generado me va a servir como
patrón para sintetizar más ADN.
Entonces lo que vamos a tener al final es el segmento de ADN que queríamos estudiar
multiplicado, es decir, vamos a tener mucho de ese mismo segmento.

Amplificación exponencial.
Entonces después que se hace el PCR, yo tengo el ADN en un frasquito, ya sabemos que lo
multiplicamos, pero necesitamos saber si lo que yo amplifique de manera exponencial
ahora realmente me funciona o es realmente lo que queriamos, entonces esto lo podemos
saber a través de una electroforesis.
En la electroforesis vamos a tener un campo eléctrico, es decir, un cátodo y un ánodo, y las
moléculas más pequeñas van a migrar y me van a permitir separar el ADN en segmentos.
Si yo amplifique el ADN que queríamos, entonces en teoría ¿Cuántas bandas deberíamos
tener cuando se hace la electroforesis? Si nosotros estamos amplificando lo que queríamos
entonces deberíamos tener una banda de ese mismo ADN que teníamos.
¿Qué otra cosa deberíamos ver cuando tengamos la electroforesis?
Siempre se ve un patrón; el patrón tiene varios tamaños y se va a distribuir a lo largo de
todo el gel de la electroforesis. Entonces tendremos el ADN que amplificamos y debemos
tener algo que me diga el número de pares de bases. El numero de pares de bases me dará
el tamaño y el tamaño me dice cuánto va a migrar desde el punto en el que yo coloque
hasta abajo; es igual como en proteínas, por ejemplo, tenemos unas proteínas (lo que
queremos investigar) y debemos tener también un patrón de proteínas.

Entonces las moléculas más pequeñas, es decir, que tengan menor número de pares de
bases van a migrar hacia abajo (hacia el cátodo), y las que tengan mayor numero de pares
de bases van a migrar hacia arriba (hacia el ánodo).

Entonces después del PCR lo ideal es hacer una electroforesis, porque esto me permite
confirmar, es decir, que después que yo amplifique ahora tengo lo que realmente quería
tener.
¿Ahora como se observan esos segmentos?
Se tiñe el gel y así se puede evidenciar si mi muestra problema según el patrón es lo que
yo quiero.
Endonuclasas de Restricción.
Estas cortan el ADN en un sitio específico, se utilizan mucho para hacer un experimento
que se llama Southern Blot, sirve para analizar ADN también.
El Southern Blot se fundamenta en una hibridación. La hibridación consiste en que yo
tengo un ADN fijado a un soporte y voy a colocar otro ADN que se va a hibridar con él.
¿Quién se hibrida? El que tenga la secuencia complementaria, porque no podemos
hibridar algo que no tenga su complementario, un ejemplo: si yo tengo una cadena que
tenga puro A A A la otra cadena debe tener puro T T T, sino es así entonces no se puede
hibridar.
(En la biología molecular vamos a ver como norte (en inglés) que es donde se analiza ARN
y el este (en inglés) que es para analizar proteínas).
En las laminas vemos una condición donde tenemos un ADN, a esta se le coloca las
enzimas de restricción, luego de esto formo una electroforesis. ¿Qué haremos con la
electroforesis? Separar los fragmentos de ADN según su tamaño; luego de recoger la
electroforesis que es en un gel, no podemos trabajar con ese gel, entonces hacemos una
transferencia de lo que yo tengo en el gel (fragmentos de ADN) a un filtro de papel.
Luego de esto vamos a tener el ADN en papel de filtro, entonces en el experimento de las
laminas vemos que ese ADN lo coloca en una bolsa plástica, ellos colocan una sonda que
me van a reconocer ciertas secuencias de ADN.
¿Cómo van a ser las sondas?
Se me van a hibridar con el ADN que tiene la secuencia complementaria, entonces todos
los nucleótidos que sean complementarios se me van a unir al papel de filtro.
Entonces tendremos muchos fragmentos de ADN, tendremos una sonda (cuando
hablamos de una, es porque tiene una secuencia en particular, pero son miles de
segmentos también) y esos segmentos de la sonda se me van a unir a los complementarios
que yo tengo en el papel de filtro; y luego de eso otra vez se neutralizan las cargas altas a
través de rayos X (revisar esto).

Secuenciación de Sanger.
Aquí utilizamos algo a lo que se le denomina 2´,3´-didesoxinucleotido.
(Recordamos que en el ADN tenemos una ribosa que no tenía hidroxilo en el carbono 2).
Ahora esta molécula no posee hidroxilo en el carbono 3 ni en el 2.
Recordar en el principio ¿cómo hacia la polimerasa para polimerizar el enlace fosfodiéster?
Recordar que el necesitaba los primers o sebador, recordamos que los sebadores nos sirven
para tener un enlace 3´-hidroxilo libre para que la polimerasa pueda actuar. Si nosotros no
teníamos ese extremo 3´-hidroxilo libre que me daba mi primers o mi sebador entonces la
polimerasa no podía actuar. Recordar que la primasa me colocaba el sebador, y a partir de
allí, yo tenía mi extremo 3´-hidroxilo libre donde me actuaba la polimerasa.
Entonces el 2´,3´-didesoxinucleotido es un nucleótido, tengo una base, una ribosa y tengo
el trifosfato. ¿Pero qué pasa? La polimerasa va a polimerizar, va tomando nucleótidos y
coloca en el segmento en donde esta sintetizando; ¿pero qué pasa cuando se encuentra con
algo como esto? ¿Qué ocurre con esa polimerización? ¿avanza o se detiene? Se detiene,
porque no tenemos el extremo 3´-hidroxilo libre.

Explicación laminas. Ir a consulta.

Entonces para verlo de esta manera, tendremos la cadena patrón, tengo mi sebador y
tenemos el extremo 3´-hidroxilo libre, ¿puede actuar la polimerasa? Si.
Vemos que tenemos una secuencia que dice T G A T, entonces ¿Cuál es la base
complementaria de C? G.
Entonces resulta que por ejemplo, mi 2´,3´-didesoxinucleotido, en donde dice base tiene
una G…
Entonces tendremos el Ependorf en donde está actuando la polimerasa, tengo mi
nucleótido, tengo mi sebador, tengo mi cadena, todo, y cuando toca colocarse el nucleótido
que tiene a la guanaina, no se coloca el, sino que se coloca el 2´,3´-didesoxinucleotido que
tiene como base a la G ¿la reacción avanza o se detiene? Se detiene, porque no tengo mi
extremo 3´-hidroxilo libre para actuar la polimerasa. Entonces se me genera un fragmento;
la cadena tiene muchos C, entonces como se me van a generar varias cadenas fijas (la
primera de ellas fue cuando se incorporo el 2´,3´-didesoxinucleotido con G), ella sigue
avanzando (en el mismo frasquito) ya se genero el primer fragmento pero son muchos que
se me van a generar. Entonces en otra fracción la polimerasa actúa y se encuentra con G; se
encuentra de nuevo con C y coloca de nuevo aleatoriamente un didesoxinucleotido con G
o puede colocar un nucleótido con G, esto es porque tengo las dos cosas en mi Ependorf.
Esto entonces es una reacción al azar que me genera fragmentos de varios tamaños,
entonces en la fracción en la cual me encontré con el didesoxinucleotido G, me genero un
fragmento. Pero en la fracción en la cual no me encontré con el didesoxinucleotido G sino
con el nucleótido G se genera una cadena más larga hasta que al azar, cuando encuentre
de nuevo a C se me puede colocar o al didesoxinucleotido y pararse la reacción o al
nucleótido G.

Observamos que tenemos 3 C en la cadena patrón ¿Cuántas veces se parar la reacción?

Tres veces. Entonces tengo 3 fragmentos al azar. Cuando hacemos la electroforesis
¿Cuántos fragmentos obtendremos? 3.
Lo mismo ocurre en los otros, en donde agrego didesoxinucleotidos, pero no se agregaran
en el mismo frasco.
Entonces si tengo didesoxinucleotidos con G, didesoxinucleotidos con A,
didesoxinucleotidos C y didesoxinucleotidos T ¿Cuántos Ependorf tengo? 4.
Entonces de cada Ependorf, vamos a tomar con una pipeta y lo colocamos en el pozo para
tener luego la electroforesis… Ependorf 1, Ependorf 2, Ependorf 3 y Ependorf 4.