Principios de Cromatografía

Biomoléculas 2013
.
 ¿Qué es la Cromatografía?
Es un método de separación
de mezclas en sus
constituyentes individuales
 Tiene dos finalidades:
 Purificación
 Análisis

Estampilla británica conmemorando al Nobel

Martin Synge por la invención de la cromatografía
 Por qué se llama Cromatografía
KHROMATOS GRAPHOS
(Color) (Escritura)

MIGUEL TSWEET (BOTANICO RUSO-1906). REALIZO LA PRIMERA

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.
Eter de Eter de
Eter de
petróleo petróleo
petróleo

Mezcla de
pigmentos
vegetales

CaSO4
 Métodos:

M ÉTO DO S CRO M ATO GRÁFICO S

SIM PLES IN STRU M EN TALES

PAPEL PLACA CO LU M N A GASES LÍQ U IDO S

Elementos básicos de la cromatografía
• Fase estacionaria Fija
Sólida: Sílica gel, alúmina,etc.
Líquida: Solventes polares, no polares, y mixtos.

• Fase móvil Se desplaza

Líquida: Solventes polares, no polares y mixtos.
Gaseosa: Gas inerte (Nitrógeno, helio, etc. )
•
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
• Se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria
manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la
placa. El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y
arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo
“manchas” de los componentes.
• Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente,
plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los tamaños
de la placa para CCD convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x
2.
• Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para
facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa
indicador y los componentes no son coloreados se requerirán
técnicas de revelado.
 CONCEPTO DE Rf.
• Rf= factor que se obtiene experimentalmente
y me permite establecer la distancia recorrida
por un soluto en relación a la fase móvil.
Aplica en las cromatografías planas
• El valor de Rf depende de las condiciones en
las cuales se corre la muestra (tipo de
adsorbente, eluyente, así como las
condiciones de la placa, temperatura, vapor
de saturación, etc.).
 Dis tan cia recorrida por el soluto desde el origen
Rf 
Dis tan cia recorrida por el frente del solvente

El frente del solvente es de 8.5, este será nuestro

denominador. Por lo tanto la primera mancha con un
numerador de 3.1 cm tiene un Rf = 0.36, mientras que la
segunda mancha un Rf= 0.68
Eluyentes más comunes para cromatografía en
capa fina.

• éter de petróleo
• -tolueno
• -dietil-éter, t-butil-éter
• -diclorometano
• -acetato de etilo
• -n-pentano, n-hexano
• -ciclohexano
• -tetracloruro de carbono
• -cloroformo
• -acetona
• -iso-propanol
• -etanol
• -metanol
• -ácido acético
 REVELADORES MÁS COMUNES PARA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Las manchas de color son inmediatamente visibles; las

incoloras pueden revelarse mediante:
• Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede
usar una fase estacionaria impregnada con un indicador
fluorescente (F254 ó F366), el número que aparece
como subíndice nos indica la longitud de onda.
• La introducción de la placa en vapores de yodo.
• El rociado con una solución de Etanol/H2SO4 1:1 (dentro
de un compartimiento especialmente protegido y bajo
una campana de extracción de gases). Después calentar
Proceso de las Fase móvil Fase móvil
separaciones
cromatográficas

Es la distribución de los
constituyentes de una Fase
mezcla entre la fase estacio-
naria
estacionaria y la fase
móvil.
Por qué se separan las sustancias?

Algunas sustancias son retenidas más fuertemente en la fase

estacionaria por:
 Su mayor polaridad, lo que favorece su adsorción en dicha
fase.
 La menor solubilidad en la fase móvil.

Otras sustancias son menos retenidas, debido a:

 Su menor polaridad, lo que disminuye su capacidad de
adsorción en la fase estacionaria.
 Su mayor solubilidad en la fase móvil
 Clasificación de la cromatografía
• Esta técnica analítica se clasifica de acuerdo a
su mecanismo de separación en cromatografía
de:
• Adsorción
• Exclusión
• Intercambio iónico
• Cromatografía de afinidad
 Cromatografía de Adsorción
Usa una fase estacionaria
sólida y una fase móvil líquida
o gaseosa
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
 Fase estacionaria: sólido.
 Fase móvil:
Líquido ( CSL)
Gas (CSG)
El soluto se adsorbe sobre las
superficie de las partículas
sólidas,
Pueden ser sistemas
líquido/sólido y gas/sólido. En
cualquier fenómeno de
adsorción influyen tres
variables:
adsorbente, eluyente y solutos.
 triglicéridos

ácidos grasos libres

diglicéridos
monoglicéridos
fosfolípidos;
otros
. compuestos
de mayor
Punto de siembra polaridad
fracción lipídica

Revelado: vainillina-ácido sulfúrico (vainillina 1% en etanol; HsSO4 20 % en etanol).

 Cromatografía de adsorción
• Cromatografía líquido/ sólido:
la fase estacionaria suele ser
gel de sílice , alúmina, carbón
activado o poliamida.
• Cromatografía gas /sólido: los
adsorbentes mas
usados son: alúmina, gel de
sílice, carbón activado y
mallas moleculares. Se
realizan en columna.
• El material que sea utilizado
como adsorbente debe
presentar una estructura
rígida, tamaño uniforme y ser
químicamente inerte.
 Cromatografía de Exclusión
• La separación está basada en los diferentes
volúmenes moleculares de los solutos.
• Se emplean geles no iónicos de partículas
uniformes y porosos, como fase estacionaria.
 También llamada de filtración por gel o de
permeación por gel.
• Separa moléculas por su tamaño, las
moléculas grandes pasan más rápido que las
pequeñas, no hay una interacción entre la
fase estacionaria y el soluto, sino que la fase
móvil pasa a través de un gel poroso.
• Los poros pequeños dejan pasar a las
moléculas grandes y las moléculas pequeñas
tardan más tiempo en pasar a través de la
columna.
 Cromatografía de intercambio iónico
• En este tipo de • Los iones de carga
cromatografía existen opuesta en solución son
aniones como: -SO3- ,o atraídos a la fase
cationes como: - estacionaria por fuerzas
N(CH3)3+ electrostáticas.
covalentemente unidos • La fase móvil es un
a la fase estacionaria líquido.
sólida, que
ordinariamente es una
resina.
 Cromatografía de intercambio iónico

Los aniones móviles

permanecen cerca de los
cationes que están
covalentemente unidos a la
fase estacionaria

Resina catiónica, que solo

fija aniones.
Resina fuertemente ácida
soporte SO3- +H + Na+ soporte SO3- +Na + H+

Resina fuertemente básica

soporte N(CH3)3+ -OH + Cl- soporte + -

N(CH3)3 Cl + -
OH
 Cromatografía de Afinidad
• Es la más selectiva, emplea interacciones de
moléculas de un soluto en particular y una
segunda molécula que está unida
covalentemente (inmovilizada) a la fase
estacionaria.
• La molécula inmovilizada podría ser un
anticuerpo unido a una proteína determinada.
• Solo la proteína que reacciona con el
anticuerpo se fija en la columna.
 Cromatografía de Afinidad
• Todas las demás moléculas se eliminan

Una clase
específica de
moléculas, se une
a la fase
estacionaria
 Disolventes comúnmente utilizados
• Pentano
• Ciclohexano
• Dioxano
• Benceno
• Éter etílico
POLARIDAD
• Cloroformo
• Cloruro de metileno
• Acetona
• Etanol
• Metanol
• Agua
 Aspectos físicos de la Cromatografía
• Cromatograma, es un gráfico que representa
la respuesta del detector en función del
tiempo de elución.
• Tiempo de retención tr, de un componente es
el tiempo necesario después de la inyección
de una mezcla en la columna hasta que ese
componente llegue al detector.
 Aspectos físicos….
• Volumen de retención
Vr, el volumen de la fase
móvil necesario para
eluir un soluto
determinado de la
columna.
• Eluyente, fluido que
entra por la columna.
• Eluato, fluido que sale
por el extremo de la
columna.
 Eficacia de la separación
• Diferencia de tiempos de elución de los
respectivos picos, cuanto más distantes sean
mejor.
• Ancho de los picos, cuanto más anchos sean
los picos, peor la separación.
 Cromatografía líquida.
• Cromatografía de líquidos de alta eficiencia
• Fase móvil, líquido a alta presión
• Fase estacionaria sólido en columnas de un
diámetro de 3 a 10 micras.
• Utiliza instrumentación especializada.
 Cromatografía de gases
• La cromatografía de gases es un método físico de
separación en el cual los componentes a separar se
distribuyen entre dos fases, una de las cuales
constituye la fase estacionaria, de gran área
superficial, y la otra es un GAS (fase móvil) que pasa
a través o a lo largo de la fase estacionaria
Componentes de un Cromatógrafo de
gases

 Un suministro y una entrada de gas de acarreo

 Puerto de inyección
 Columna normalmente localizada en el interior de una
cámara termostatizada (horno)
 Detector
 Sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir
el cromatograma
Cromatógrafo de gases
 Inyección de la muestra
• Las muestras líquidas se
inyectan mediante una
jeringa a través de
septum, en un inyector
caliente.
• El gas portador arrastra
la muestra vaporizada
desde el inyector a la
columna
 Gas portador
•El gas portador cumple básicamente dos propósitos:
•Transportar los componentes de la muestra
•Crear una matriz adecuada para el detector.

•Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:

– Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como
con la fase estacionaria)
– Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa
– Fácilmente disponible y puro
– Económico
– Adecuado al detector a utilizar
 Detectores:
Un detector nos indica qué sale
de la columna. Los detectores más comunes y
utilizados son:
• Conductividad térmica  Conductividad electrolítica
• Llama ionizada  Fotoionización
• Captura de electrones  Infrarrojo
• Detector de N y P  Selectivo de masa
• Fotométrico de llama  Etc.
73 CROMATOGRAFÍA
Preguntas?