Centro Azúcar 2/2001

Determinación de Lourdes Casas Cardoso,

Vladimir Cabrera Díaz,
azúcares reductores Raúl Fajardo García;
en miel final por Facultad de Química y
Farmacia, UCLV
Cromatografía Líquida
de Alta Resolución
Recibido: octubre/2000
Aprobado: febrero/2001

Se describe un método de Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC) que

permite cuantificar los azúcares reductores (glucosa y fructosa) en las mieles finales.
Para ello fue necesario realizar una reacción de derivatización en la que se utilizó
como reactivo el clorohidrato de fenilhidracina. Luego se procedió a seleccionar las
condiciones de trabajo, para lo cual se eligió una columna RP-18 y una mezcla de
acetonitrilo: agua (40:60), como fase móvil. El sistema de detección utilizado fue un
detector de fotodiodos a la longitud de onda de 370 nm. Mediante el uso del HPLC se
observaron diferencias significativas en rerlación con los resultados obtenidos por
métodos convencionales.

Palabras claves: Azúcares reductores, Cromatografía Líquida de Alta Resolución

A High Performance Liquid Chromatography method allowing quantification of the

glucose and fructose present in finals sugar cane syrup, is described in this paper.
These substances were eluted for RP-18 column using acetonitrile with water (40:60)
and detected UV-VIS spectrophotometrically by pre-column derivatization with
chlorohidrate of fenilhydrazine. Through this method, the deviation of values obtained
with conventional methods can be readily observed.

Key words: Sugar reducers, High Performance Liquid Chromatography

INTRODUCCIÓN En la Universidad Central “Marta Abreu” de Las

La sociedad moderna tiene la necesidad de
fomentar la producción de los alimentos llamados
orgánicos, que no son otra cosa que productos
obtenidos sobre la base de una agricultura
orgánica, en la que toda la agrotecnia es natural
y por lo tanto no se utilizan fertilizantes químicos
ni herbicidas, sino abonos orgánicos, control de
plagas por vía biológica y laboreo con
preservación del medio.
En los últimos años en algunos países se ha
comenzado la producción de azúcar orgánica, la
que ha alcanzado precios elevados en
comparación con el precio del azúcar crudo nor-
mal.
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Villas, el Centro de Estudio de Termoenergética
Azucarera (CETA) opera la Planta Piloto “José
Martí” que produce azúcar orgánica, por lo que
es necesario establecer un riguroso control del
azúcar que se obtiene allí para garantizar la
calidad del producto, pero no siempre se dispone
de las técnicas más confiables para cumplir con
este control.
La presencia de azúcares reductores libres
afecta la calidad del azúcar crudo y de la
melaza, pues en general y bajo determinadas
condiciones, sufren transformaciones hacia
compuestos no asimilables en mucho mayor
grado que los disacáridos.4,5
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Conocer la concentración de los azúcares
reductores contribuye a evaluar los diferentes
productos y subproductos dentro del proceso
fabril, por lo que es necesario contar con técnicas
analíticas de elevada exactitud, precisión y
sensibilidad para su cuantificación; más aún si se
tiene en cuenta que se trata de alimentos
orgánicos en los que es mucho más riguroso el
control de la calidad.
Los métodos cromatográficos son en la
actualidad una herramienta imprescindible para
la determinación rápida y específica de azúcares.
Esto supone una notable mejora frente a los
análisis tradicionales donde las interferencias
presentes en la matriz y el consumo elevado de
tiempo suponen serios inconvenientes.
La Cromatografia Líquida de Alta Resolución
(HPLC) es una técnica que se ha venido usando
en la industria azucarera por más de una década.
Esta técnica permite la separación, identificación
y estimación cuantitativa del azúcar presente en
un rango de productos de la casa azucarera, tales
como: jugo de caña de azúcar, jarabe, azúcar
crudo y melaza.
Para utilizar el HPLC con fase reversa (RP-18) y
detector UV-VIS, es necesario realizar una pre-
via derivatización de los azúcares por reacción
primaria. Al menos se requiere un grupo metoxi
u otro menos polar para que la selectividad se
vuelva importante. Existe una gran variedad de
métodos que se han desarrollado para la
determinación de monosacáridos,1,2,3 los cuales
permiten su análisis en diferentes matrices
complejas, con el empleo de fases móviles
acuosas, en presencia de acetonitrilo como
modificador.
En este trabajo se describe un método por
Cromatografía Líquida en Fase Reversa (RP-
HPLC) que permitió cuantificar los azúcares
reductores presentes en las mieles finales de la
Planta Piloto “José Martí” de la UCLV.
MATERIALES Y MÉTODOS
La derivatización pre-columna se realiza
utilizando como reactivo el clorohidrato de
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fenilhidracina. Para ello se coloca una muestra
de 0,2 g de glucosa y fructosa patrón,
respectivamente, en dos tubos de ensayo. A cada
uno se añade 0,2 g de clorohidrato de
fenilhidracina, 0,3 g de acetato de sodio y 2 mL
de agua destilada. Se tapan los tubos con tapones
agujereados y se colocan juntos en un cubilete
con agua hirviente. Bajo esas condiciones la
osazona de la fructosa precipita en 2 minutos y
la de la glucosa en 4 ó 5 minutos. Después se
sacan del agua caliente a los 30 minutos y se
enfrían a temperatura ambiente.
Para comprobar la formación del derivado se
toma una alícuota de 10,0 µL y se aplica sobre
una placa de silicagel (de 5x5 cm), previamente
activada. Esta se introduce en una cámara
cromatográfica que contiene al eluyente,
cloroformo/metanol/agua en proporción 10:10:1
y que se encuentra saturada con sus vapores.
Las determinaciones analíticas se realizan en un
cromatógrafo líquido de alta resolución, marca
Knauer con un detector espectrofotométrico de
fotodiodos de la firma LKB, modelo 2140,
dotado de 180 fotodiodos. Se utiliza una columna
de octadecilsilano ODS 2 Spherisorb ODS 2, a
25 0C (15 cm x 0,46 mm de d.i. y 5 µm de
diámetro de las partículas del relleno), que son,
sin dudas, las de mayor uso en la actualidad.
Como fase móvil se emplea una mezcla de
acetonitrilo:agua en proporción 40:60, y con una
velocidad de flujo de 0,2 mL/min.
Se realizan, además, determinaciones de
reductores por el método de Eynon-Lane, que
es la técnica que se utiliza a diario en los centrales,
con el objetivo de compararlas con los resultados
obtenidos por HPLC.
El análisis estadístico de los resultados se efectuó
utilizando el SPSS.
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
Debido a las condiciones de equipamiento
existentes (columna RP-18 y detector UV-VIS)
es imprescindible derivatizar los azúcares para
poderlos analizar por HPLC. El clorohidrato de

fenilhidracina presenta el inconveniente de que los dos reductores a determinar: glucosa y fructosa,
forman la misma osazona. Sin embargo, el estudio de la mezcla de reacción por Cromatografía de
Capa Delgada (CCD) permite corroborar que dicha reacción es cuantitativa, tal como se muestra en
el cromatograma que aparece en la figura 1.
Figura 1. Cromatrograma
La reacción de formación del derivado es la siguiente:
H H
C O C N
+ 3 C 6H5 NHNH2
H C OH C N
R R
Con el objetivo de seleccionar la longitud de onda
de trabajo para la técnica de HPLC se realizó un
espectro a este derivado en la región comprendida
entre 190–420 nm, utilizando para ello un
espectrofotómetro UV-VIS VITROSPEC III
modelo 80. 2097-62 LKB. Este espectro presenta
dos máximos de absorción, uno a 270 nm y el
otro a 370 nm, siendo este último el de mayor
intensidad, por lo que se escoge esa longitud de
onda para realizar las determinaciones.
Análisis de los derivados obtenidos
La tabla 1 muestra los cromatogramas obtenidos,
bajo las condiciones cromatográficas descritas,
para una muestra de glucosa y fructosa
derivatizada.
Tabla 1. Resultados obtenidos de los cromatogramas
de glucosa y fructosa derivatizadas
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NHC 6 H5
+ NH3 + C 6 H 5 NH 2 + 2 H2O
NHC 6 H5
En ambos derivados se observa un pico a un
tiempo de retención de 7,9 minutos con una altura
muy superior al pico de 1,7 minutos que aparece
en el cromatograma de la glucosa. Al analizar
las características cromatográficas del pico de
7,9 minutos para los dos derivados, se observa
que presentan la misma simetría y ancho en la
semialtura. Al enriquecer el derivado de glucosa
con el de la fructosa se obtuvo un cromatograma
cuyo pico a 7,9 minutos coincidía con las
características cromatográficas anteriormente
descritas, con la diferencia de que su altura era
aún mayor. También se comprobó que el espectro
correspondiente a ese pico es similar al espectro
que se le realizó a la osazona en el espectrómetro
UV-VIS. De todo este análisis cualitativo se
infiere que este pico se corresponde con el
derivado.
Estudio sobre algunos parámetros de
validación de la técnica HPLC
Linealidad
Los datos obtenidos de la curva de calibración
para los 2 reductores bajo estudio aparecen en
la tabla 2:
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Tabla 2. Resultados de la curva de calibración de la glucosa y
proporcionalidad. Esto se verifica,
fructosa respectivamente ya que la probabilidad de la sig de
t es mayor que 0,025, en ambos
casos.6

Al examinar el valor del

intercepto (a) y el de la
pendiente (b) para la recta de
regresión del derivado de la
fructosa, se observa que están
comprendidos respectivamente
dentro de los límites de
confianza de la curva de
regresión que corresponde al
f: factores respuesta derivado de la glucosa. Este
h: altura del pico resultado es lógico, ya que
ambas rectas de calibración son
En la tabla 3 se observa que las ecuaciones estimadas para estadísticamente idénticas, pues,
los derivados de la glucosa y fructosa presentan coeficientes aunque se partió de diferentes
de correlación de 0,999, lo que refleja el grado de relación azúcares, el proceso de
entre las variables concentración y altura.
derivatización conduce al mismo
producto. Además, estas rectas
Tabla 3. Resultados obtenidos del procesamiento estadístico de calibración fueron efectuadas
con ayuda del SPSS con el mismo procedimiento
analítico y con series de
concentraciones similares.

Precisión

Repetibilidad del método

En la tabla 4 se muestran los

resultados obtenidos al repetir el
análisis, este procedimiento
incluye todo el tratamiento,
desde la preparación hasta la
Ambas ecuaciones cumplen con el test de lectura instrumental.
linealidad, ya que los valores de probabilidad de
la significación de b son menores que 0,025. El
CVf es menor que el 5 %, para ambas curvas, lo
que indica que los factores respuesta son cercanos
Tabla 4. Parámetros estadísticos del
entre sí y cercanos al valor de la pendiente.
estudio de la repetibilidad del método
Además, el Sb relativo es menor que el 2 % para
las dos curvas.

Los límites de confianza del término

independiente de cada recta incluyen al cero, por
lo que se cumple la condición de
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Teniendo en cuenta que el método analítico Tabla 6. Resultados obtenidos por el método
requiere un tratamiento previo de la muestra, HPLC y Eynon-Lane en miel final
además de ser una matriz compleja, consideramos
que el C.V. es adecuado. Este valor es < 3 %,
que es el criterio establecido según lo reportado
en la literatura.6

Reproducibilidad del método

En la tabla 5 se expresan los resultados obtenidos

del análisis en días diferentes.

Tabla 5. Parámetros estadísticos del estudio de la

repetibilidad del método
El análisis del C.V. obtenido es < 5 %, lo que
permite inferir que la reproducibilidad del método
es adecuada.
Teniendo en cuenta los resultados del estudio de
precisión se considera que el método es preciso.
Exactitud
Se realizó un Test de student para determinar si
el valor medio hallado en 10 réplicas y el valor
verdadero difieren significativamente para un
nivel de significación del 5 %. Al realizar el
procesamiento la sig t (0,607), resultó ser mayor
que 0,025, cumpliéndose así con el parámetro
de exactitud.
Al analizar los resultados
obtenidos por ambos métodos de
análisis se ha encontrado que
existen diferencias significativas
entre ellos. La causa de estas
diferencias radica en que existen
interferencias en la matriz que no
se eliminan antes de emplear el
método de Eynon-Lane. La técnica de RP-HPLC
no presenta estos inconvenientes, y aunque el
equipamiento es muy caro en comparación con
los métodos tradicionales que se utilizan en los
Complejos Agro Industriales azucareros, no se
debe perder de vista que en este caso se está
trabajando con productos orgánicos, donde el
control del proceso debe ser muy riguroso.
CONCLUSIONES
1. Se comprobó por CCD que el clorohidrato
de fenilhidracina puede ser utilizado en la
derivatización de los azúcares reductores
para su posterior determinación por RP-
HPLC con detector espectrofotométrico.

Análisis de muestras reales 2. La técnica propuesta para el análisis de

azúcares reductores (fructosa y glucosa) en
Según las condiciones de trabajo previamente
las mieles finales, cumple con los parámetros
seleccionadas, y teniendo en cuenta el
de linealidad y precisión.
cumplimiento de algunos de los parámetros de
validación estudiados, se aplicó esta técnica a la
3. Las diferencias que existen entre los valores
determinación de reductores en miel final. El
reales y los determinados por la técnica
método de cuantificación empleado fue el del
convencional, muestran la necesidad de
patrón externo.
encontrar, para quienes no poseen HPLC,
técnicas alternativas de análisis rutinario con
Los resultados obtenidos por este método y por
menor error.
Eynon-Lane se muestran en la tabla 6.
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FUENTES DE INFORMACIÓN CONSULTADAS

.
1. Díaz, H. F.: “Determinación de sacarosa, glucosa y fructosa en jugo de caña de azúcar por
HPLC”, Revista Industrial y Agrícola de Tucumán, 69 (1-2): 87-92, 1992.

2. Jansen, Ch.: “New Developments in HPLC of Carbohydrates Mono-and Disaccharides”,

Chemical Abstract, Labor Praxis, 13(1/2) , 56, 58-60 (German) 1989, Section:80 (Or-
ganic Analytical Chemistry).

3. Sorensen, Susanne H. et al.: “A novel HPLC Method for the Simultaneous Quantification
of Monosaccharides and Disaccharides Used in Tests of Intestinal Function and Perme-
ability”, Chemical Abstract, Clin. Chim. Acta, Section: 9 (Biochemical Methods)
221(1-2): 115-25 (English), 1993.

4. Otero, M.A.; A.Torres; A. Reyes: “Efecto inhibitorio de las melanoidinas sobre el

crecimiento de Candida utilis” en 2do Seminario Internacional de Azúcar y Derivados de
la caña, La Habana, abril 10-13, 1990.

5. Trudgill, P. W.: “The Microbial Metabolism of Furans” en Microbial Series Microbial

Degradation of Organic Compounds, p. 295, ed. P.W. Trudgill, Elsevier Publishers,
London, 1984. a

X Simposio de Ingeniería Eléctrica: SIE 2001

Del 10 al 12 de mayo, en la Universidad Central «Marta Abreu»
de Las Villas, en Santa Clara, Cuba

Temáticas: Automatización: Instrumentación. Sistemas distribuidos de medición

y control. Teoría y métodos de control. Aplicaciones de inteligencia artificial.
Optimización energética de instalaciones. Robotica.
Electrónica: Instrumentación electrónica. Ingeniería biomédica. Equipos médicos.
Procesamiento digital de señales. Audio, televisión y vídeo, ASIC´s.
Telecomunicaciones: Redes de comunicaciones. Sistemas de transmisión y
comunicación telefónica. Comunicaciones móviles y personales. Radiopropagación
y antenas, Comunicaciones vía satélite.
Electroenergética: Máquinas eléctricas. Accionamiento eléctrico. Sistemas eléctricos
de potencia Protecciones eléctricas. Sistemas de energía no convencional y
alternativas. Instalaciones eléctricas industriales.
Enseñanza asistida por computadoras: Aprendizaje automático. Multimedia.
Hiperlibros. Universidad Virtual
Cuota de inscripción: 150,00 USD. Se pagará en el momento de la acreditación
en el evento.
Comité organizador: Dr. Francisco Herrera Fernández
Teléfono: (53) (422) 81632
FAX: (53) (422) 81608
E-MAIL: herrera@uclv.etecsa.cu

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