CURSO DE

CROMATOGRAFÍA.
(TEÓRICO-PRÁCTICO)

CONFERENCIA: I
TERMINOS Y CONCEPTOS BÁSICOS DE LA
CROMATOGRAFÍA

Lic Arturo Escobar Medina DrC

Profesor titular C Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco (UAM)
Investigador Titular . Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. (CENSA)
PROFESORES:
DrC José Jesús Pérez González
MsC. Beatriz Schettino Bermúdez
MsC Marcela Vásquez Francisca.
Programa del curso

 I Fundamentos teóricos de la Cromatografía

Liquida (CLAR o HPLC) y Cromatografía
Gaseosa.
 II Instrumentación
 III Análisis Cualitativos y Cuantitativos
 IV Metodología para la validación de un
método cromatográfico
 V Particularidades en la preparación de las
muestras para la determinación de residuos
y contaminantes en Alimentos.
 VI Problemas mas frecuentes en la
cromatografía
 VII Aspectos generales en la aplicación de
Buenas Practicas de Laboratorio
 Clases Practicas: Determinación de
Aflatoxinas en alimentos por HPLC y perfil
de ácidos grasos por CG.
OBJETIVOS DE CURSO

1. Aportar los conocimientos teórico-prácticos

para poder realizar y/o dirigir los métodos
instrumentales de separación.
2. Profundizar en los sistemas de validación
de un ensayo cromatográfico que permitan
obtener resultados confiables
FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA
CROMATOGRAFÍA
 Fundamentos teóricos de la Cromatografía

 Concepto.
 Clasificación y modalidades
de la cromatografía
 Historia de la cromatografía
 Aspectos considerar antes
de realizar un análisis
cromatográfico.
 Modalidades de la
Cromatografía Líquida y
Gaseosa.
 Términos y conceptos
 Aspectos teóricos de la
cromatografía.
 ¿Qué es la cromatografía?
 ¿Qué modalidades conocen
ustedes de la cromatografía?
 ¿Cómo ustedes consideran que
ocurre la separación de una
mezcla de componentes?
CONCEPTO Y
MODALIDADES CROMATOGRÁFICAS
CROMATOGRAFÍA

 La cromatografía es un método, usado primariamente

para la separación de los componentes de una muestra,
en la que los componentes se distribuyen en dos fases,
una de las cuales es estacionaria, mientras la otra es
móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido, un
líquido retenido sobre un sólido o un gel. La fase
estacionaria puede estar extendida o distribuida como
una película, etc. La fase móvil puede ser líquida o
gaseosa” (IUPAC, 1974).

La cromatografía, por lo tanto, está destinada a la

separación de mezclas de sustancias complejas en sus
componentes.
 CROMATOGRAFIA
Princípio Básico

Interacciones

Puente de hidrógeno
Hidrofóbica
Dipolares
Electrostática

Migración de zonas
(Guidding)
 MODALIDADES DE LA CROMATOGRAFIA

Naturaleza de la fase móvil

FM = Gás FM = Líquido

Cromatografia Gaseosa (CG) Cromatografia Líquida

Sólida FE Líquida FE
Sólida Líquida
Cromatografia Cromatografia
Gás-Sólido (CGS) Gás-Líquido (CGL)
adsorción Cromat. de adsorción en columna
Cromat. en capa fina
HPLC
20% DE LAS SUSTANCIAS Cromat, Líquido
o de partición
SE ANALIZADAS
(Martin y Singe 1952)
 MODALIDADES DE LA CROMATOGRAFIA

Naturaleza de diferenciar los componentes

Cromatografía en el espacio: Los componentes son

visualizados espacialmente separados, de forma que es
posible así detectarlos con algún revelador, y aislarlos al
detener el proceso en un momento dado. Ej. : Cromatografía
en papel, Cromatografía en capa fina (TLC) y determinados
tipos de técnicas cromatográficas de columna.

A) Cromatografía en columna.

FE=Columna
FM eluye bajo presión

B) Cromatografía plana.

FE=Plato,
FM eluye por gravedad
 MODALIDADES DE LA CROMATOGRAFIA

Naturaleza de diferenciar los componentes

Cromatografía en el tiempo: Los componentes de la mezcla

tienen como característica distintiva el poseer diferentes
tiempos de permanencia en el sistema cromatográfico,
gracias a lo cual pueden ser separados y/o colectados a la
salida del mismo. Ejemplos de este tipo de separación son la
mayor parte de las separaciones en columna, cromatografía
de gases y de líquidos.

A) Cromatografía liquida.
FM= liquido
B) Cromatografía de gases.
FM= gas
C) Cromatografía de fluidos
supercríticos.
FM= fluido supercrítico
 Por mecanismos de separación

 CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN O  Se aplica en la separación de compuestos

no polares de bajo peso molecular
CROMATOGRAFÍAS DE FASE NORMALES  Ventajas: capacidad para diferenciar
compuestos isómeros de mezclas.

La fase estacionaria es un sólido,

habitualmente sílice, aunque en algunas
ocasiones se emplea alúmina finamente
dividida. Las características de absorción en
ambas columnas son similares y en ambas los
tiempos de retención se alargan a medida
que la polaridad del analito aumenta. El
analito queda retenido en la fase estacionaria
mediante fenómenos de adsorción.
 Por mecanismos de separación

EJEMPLO: Compuesto polar Se retiene muy fuerte en la fase estacionaria

Ordenación de algunos compuestos orgánicos de menor a mayor polaridad

puede ser: Alcanos, Alquenos, Éteres, Hidrocarburos halogenados,
Hidrocarburos aromáticos, Aldehídos y Cetonas, Ésteres, Aminas, Alcoholes
y Tioles, Fenoles y Ácidos carboxílicos.
Por mecanismos de separación

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO  CARACTERÍSTICAS

1. La fase estacionaria líquida

esta retenida sobre las
partículas de relleno
2. Una fase será polar mientras
la otra apolar
3. La separación se basa en
diferentes polaridades del
soluto
4. Sirva para separar
sustancias no polares y
polares sin carga con un
peso inferior a 3000 daltons.
Por mecanismos de separación: Cromatografía de Reparto
 FASE NORMAL: la fase móvil es un
disolvente apolar o poco polar (como
el hexano o el isopropiléter) y la fase
estacionaria presenta elevada
polaridad (el grupo R es polar).
 Primero eluyen los menos polares
 Si aumenta la polaridad en la FM se
disminuye los tiempos de elución
 FASE INVERSA O REVERSA: la fase
móvil es un disolvente relativamente
polar (disoluciones acuosas con
etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano)
y la fase estacionaria es apolar (el
grupo R es un n-octilo, C8, o n-
octadecilo, C18).
 Primero eluyen los mas polares
 Si aumenta la polaridad en la FM se
aumentan los tiempos de elución
Representación de una mezcal de compuesto con
distintas polaridades.
 EJEMPLO de como calcular el índice de polaridad de
una mezcla de soluciones.

Calculemos como cambia el índice de polaridad de una mezcla de hexano

cloroformo cuando pasa de un concentración inicial del 90% de hexano a un
50% al final del gradiente. Si consideramos que el P del hexano es 0,1 y la P
del cloroformo es 0.41

Respuesta : P Hexano:Cloroformo =.9x0.1 + .1X0.41 = 0.5

Respuesta : P Hexano:Cloroformo =..5x0.1 + ..5X0.41 = 21

 Por mecanismos de separación
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
MOLECULAR
A diferencia de otros modos de
cromatografía, se basa en la ausencia de
interacciones entre el analito y la fase
estacionaria empaquetada en la columna.
 CROMATOGRAFÍA IÓNICA
La retención se basa en la atracción
electrostática entre los iones en solución y
las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga
son excluidos mientras que los de carga
opuesta son retenidos por la columna.
(catiónica o anionica)
RESUMIENDO POR LOS MECANISMOS
Cromatografía de fluidos supercríticos.

 La cromatografía de fluidos
supercríticos (SFC) emplea fluidos
supercríticos como fase
móvil. Un fluido supercrítico se
forma cuando una sustancia se
encuentra por encima de su presión y
temperatura críticas (punto crítico):


Separa compuestos que no pueden ser separados por CG ni CL:

(1) Compuestos no volátiles termolábiles en los que no se puede aplicar

CG.
(2) Compuestos que tienen grupos funcionales no detectables por
técnicas espectroscópicas o electroquímicas empleadas en CL.
MODALIDADES DE LA CROMATOGRAFIA
La cantidad de Muestra Aplicada
HISTORIA DE LA CROMATOGRAFÍA
HISTORIA: CROMATOGRAFIA DE GASES

El inicio de la técnica de cromatografía de gases re remonta al año de 1850 con la

separación de anilinas realizada por F.F. Runge

El científico Ruso Mijail Stwett presento el primer modelo de cromatografía

en columna utilizando éter de petróleo

Martín y Singe propusieron la Teoría de la cromatografía de partición la

cual afirmaba que se podía utilizar un gas como fase móvil del
cromatógrafo

1952 se pudo por fín realizar la primera CG pero solamente era funcional
para ácidos o bases

En 1954 se logró el primer cromatógrafo de Gases por el científico Ray N.H

M. TSWEET (1903): Separación de mezclas de pigmentos
Vegetales.
Martin Y Synge (1941) Cromatografía partición L-L.
BonLdingh (1948) Cromatografía líquida de fase reversa.
Van Deemt (1956) Teoria de la cromatografía.
S. More (1958) Cromatografía de Intercambio iónico.
Flodin (1959) Cromatografía de tamaño de exclusión.
J. C ,More (1964) Cromatografía de permeación en Gel.
Horváth y Lipsky (1966) Detector UV

A mediado de 1970 se desarrolló el HPLC y mejorando

rapidamente con la introducción de columnas empacadas y
dectores en Líneas.
A finales de 1970 se introduce la cromatografia de fase
reversa-
En la década del 80 Se introduce la automatización y la
computadoras, ademas se mejoran las columnas (col de afinidad)
y comienza surgir la fast tHPLC.
Em la década de 90 se completa el desarrollo de minicolumnas y
de columnas especializadas y columnas Fast-HPLC con tamaño
de 3mm y diametro entre3-200 µm.
 CROMATOGRAFÍA . EVOLUCION HISTORICA (HPLC)

HPLC

Tamaño de partículas
Detectores
Sistema de gestión de la informacion
ASPECTOS A CONSIDERAR ANTES DE
REALIZAR UN ANALISIS CROMATOGRAFICO
 Estructura química del soluto.
 Peso molecular
 Punto de ebullición
 Solubilidad
 Estabilidad térmica
 Polaridad
 Toxicidad
 Estado físico de la sustancia de interés
 Concentraciones a detectar
 Complejidad de la separación
 Sustrato analizado
La estructura química del soluto y su peso molecular

 Definen en gran medida qué

tipo de técnica de separación
cromatográfica se deberá
utilizar:
 CG se destina por lo general a
sustancias de peso molecular
bajo (de 1 a 200- 400 Da)
 HPLC, en sus múltiples
variantes de separación, se
utiliza para sustancias de
pesos moleculares mayores,
que pueden llegar hasta más
de 1000 KDa para proteínas,
polipéptidos y otros polímeros.
Punto de ebullición y Polaridad

 El punto de ebullición determina el estado físico de la sustancia,

o sea, si ésta es no volátil a temperatura ambiente o superior, y,
por tanto, si podrá ser analizada mediante CG u otra técnica
cromatográfica. La CG será utilizable siempre que la sustancia a
analizar sea estable térmicamente a la temperatura de
operación del cromatógrafo de gases. Si ésta se descompone
con la temperatura, es necesario aplicar antes del análisis un
proceso de derivatización para convertirla en su derivado volátil,
o aplicar otro tipo de separación cromatográfica, como TLC o
HPLC
 De acuerdo con su polaridad, una sustancia podrá ser soluble
en disolventes apolares o polares. La solubilidad define si un
compuesto es analizable o no mediante técnicas
cromatográficas. Las sustancias insolubles no son generalmente
analizables directamente: se requiere aplicar previamente un
proceso de derivatización o hidrólisis, que permita convertirlas
en derivados solubles
Toxicidad, Concentración Sustrato

 Si la toxicidad de la sustancia a analizar es elevada, no se

recomienda la aplicación de grandes concentraciones
manualmente o utilizar sistemas de detección no destructivos.
En los casos necesarios, se deben implementar las medidas de
seguridad en la manipulación de ésta, apropiadas para prevenir
la ocurrencia de perjuicios en la salud del analista.
 La concentración analizada y el sustrato de interés determinan
el proceso de preparación de la muestra que se aplicará.
 Si la separación implica a numerosas sustancias con
características comunes o no, ello define las condiciones de
operación del equipo utilizado: las separaciones relativamente
simples son menos exigentes tanto las separaciones de muchas
sustancias en un mismo análisis requieren de condiciones de
separación muy definidas y optimizadas, generalmente más
costosas

TIPO DE LAS SEPARACIONES MAS
EMPLEADA EN LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Características de la Fase estacionaria

 Composición química de la fase: la mayoría de las fases

estacionarias son de silicagel. La silicagel está constituida
fundamentalmente por óxido de silicio hidratado, con un área
superficial superior a los 200 m2/g. y un volumen de poros de
alrededor de 1 ml/g. Nuevas alternativas de fases son polímeros que
amplian el rango de pH.

 Forma de las partículas: los dos tipos de formas de partículas más

usuales: la lirregular y la esférica. La esférica presenta menor
resistencia al paso de la FM y mayor resistencia mecánica.

 Porosidad de las partículas: el número y tamaño de los poros de la

superficie de la fase estacionaria define dos de sus propiedades más
importantes: su superficie específica y su capacidad de realizar la
separación. La Cromatografía de FR y FN emplean poros entre 50-
300 A0, la cromatografía de exclusión 300-4000 A0 .

 Diámetro de partículas el rango de mayor uso es 5-10 para

cromatografía analíticas, cromatografía preparativas mayores de10
y menores de 3 las columnas del tipo FAST HPLC.
Fases estacionarias químicamente ligadas
más comunes de HPLC:

Modificación Grupo químico Nombre común Tipo de separación/ Usos más comunes
química ligado

C2 Etilo RP-2 Fase Reversa/ Poco usada

C4 Butilo RP-4 Fase Reversa/ Péptidos y proteínas

C8 Octilo RP-8, OS Fase Reversa/ Uso general

C18 Octadecilo RP-18, ODS Fase Reversa/ Uso general

C6 H5 Fenilpropilo Fenil Interacción hidrofóbica/ Proteínas

CN- Cianopropilo Ciano Fase Normal/ Uso general

NO2 Nitrofenilpropilo Nitro Fase Normal/ Uso general

NH2 Aminopropilo Amino Fase Normal/ Carbohidratos

OH- Diol Diol Fase Normal/ Proteínas

N(CH3)2 Dimetilamino WAX IEC/ Intercambiador aniónico débil

SA Ácido sulfónico SCX IEC/Intercambiador catiónico fuerte

SC Amina cuaternaria SAX IEC/Intercambiador aniónico fuerte

 Cromatografía de reparto

La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía

Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente.

La cromatografía unida químicamente es más usada debido a

que la cromatografía líquido-líquido necesita de un
recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a
la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase
móvil.

Los rellenos de columna en la

cromatografía de fase unida
químicamente se clasifican como de
fase inversa cuando el recubrimiento
enlazado tiene carácter no polar, y de
fase normal cuando el recubrimiento
contiene grupos funcionales polares.
 Fase inversa o reversa
Mas ampliamente utilizada
Solvente de alta polaridad-solutos de alta
polaridad eluyen en primero.
R= mas común- C8 (n-octil) o C18 (n-octildecil)
Los grupos están en posición perpendicular a la superficie
generando una estructura de cepillo o brocha.
Cuanto mayor es el numero de átomos de carbono en R mayor
es la eficacia.
Elución a pH>7.5 puede ocurrir hidrólisis del siloxano
Fase inversa o reversa
 APLICACIONES DE LA
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
 Cromatografía de Adsorción

Las únicas fases que se utilizan

en este tipo de cromatografía
son la sílice y la alúmina.
Es adecuada para compuestos no
polares ( PM inferiores a 5 000).

Silicagel (ácida)
Alumina (bàsica)

Se pueden separar compuestos

con diferentes grupos
funcionales. Una característica
particular de este método es su
capacidad para diferenciar
compuestos isómeros en
(Fuerzas de Van der Waals)
mezclas.
 Fase Normal

FM de baja polaridad/ FE polar

Desventaja resulta dificils mantener la proporción de agua
Solutos poco polares eluyen primero
Incrementar la polaridad de la FM tienen el
efecto de reducir el tiempo de elución.
R-Polar- ciano, diol, amino, dimetilamino.
FM-baja polaridad- etil éter, cloroformo,
hexano
SILICA GEL son polimeros no cristalino de oxido de silicio
hidratado (SiO2)n.H2O pH 2-8

SILANOL Si-OH
SILOXANO Si-O-S
 Cromatografía de Intercambio Iónico

La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee

grupos iónicos unidos covalentemente y contraiones móviles que
pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase
móvil (líquido).

amino terciario –N(CH3)3+OH−(base fuerte) sulfónico–SO3−H+(ácido fuerte)

amino primarios –NH3+OH−(base débil) carboxílico –COO−H+ (ácido débil)
Cromatografía de Intercambio Iónico
Cromatografía de Intercambio Iónico
 Cromatografía de Intercambio Iónico

Para separación de cationes se utiliza un intercambiador aniónico en la

columna supresora:
H+(ac) + Cl−(ac) + Resina+OH−(s) →Resina+Cl−(s) + H2O
Para separación de aniones se utiliza un intercambiador catiónicoen la
columna supresora:
Na+(ac) + HCO3−(ac) + Resina−H+(s) →Resina+Cl−(s) + H2CO3(ac)
Cromatografía de Intercambio Iónico
 APLICACIONES DE LA
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
 APLICACIONES DE LA
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
Cromatografía de Exclusión

Se basa en la penetración de las moléculas en los poros de la

fase estacionaria.
El tiempo de elución es proporcional al peso molecular.
No existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la
fase estacionaria.

Las moléculas de tamaño grande se

excluyen totalmente y son eluidas en
primer lugar, mientras que las de
pequeño tamaño tienen acceso a todo
el volúmen poroso y son las últimas
que se eluyen.

Factores que determinan la separación

de las moléculas son el tamaño del
poro, el tamaño de la partícula y el
flujo de elución.
Cromatografía de Exclusión

Rellenos

Silica:
Ventajas: gran rigidez (empleo de
presiones elevadas), mayor
estabilidad (gran variedad de
disolventes), estable a T elevadas.
Desventajas: tienden a retener
solutos por adsorción, puede catalizar
la degradación del soluto.

Poliméricas:
Ventajas:control del tamaño de poro
controlando el grado de
entrecruzamiento. Polímeros
hidrofóbicos e hidrofílicos, tamaños de
poros en el rango de cinco órdenes de
magnitud.
Desventajas:deformable (limita la
presión)
Cromatografía de Afinidad

Se usa fundamentalmente para la purificación de biomoléculas,

en las que una sustancia predeterminada se fija como ligando a
la superficie de la fase estacionaria. Este ligando reconoce
selectivamente y capta las moléculas afines con ella de forma
reversible, de forma tal que un incremento en el poder de
elución de la fase móvil hace eluir a la molécula retenida
selectivamente.
TÉRMINOS Y CONCEPTOS BÁSICOS
Términos y conceptos

Proceso por el cual la FM atraviesa la columna

Eluyente columna eluato

Velocidad de flujo (mL/min)

volumen de disolvente que atraviesa la columna
por minuto

Velocidad de flujo lineal (cm/min)

longitud de columna atravesada por el disolvente
en un minuto

Representa físicamente los espacios intersticiales

entre las partículas empaquetadas en la columna
que son accesibles a la FM, e incluye además los
V0 volúmenes internos del sistema
Constante de reparto o factor de
retención, de capacidad.

Conc. molar en la fase estacionaria

k’ =
Conc. molar en la fase móvil

Factores que influye en la constante de reparto:

Naturaleza de la fase estacionaria
Temperatura
Naturaleza y concentración del soluto
Naturaleza de la fase móvil
Flujo.

Velocidad de migración del soluto

La velocidad de migración se determina por la longitud
de la K de equilibrio para las reacciones en las que los
solutos se distribuyen entre la fase móvil y la F.S.
vel. = 1/K’
t0

tR

t´R t'R = tR - to
Volumen de retención (Vr )

Es el volumen de fase móvil que atraviesa el

sistema cromatográfico desde que se inyecta la
muestra hasta que emerge el máximo del pico.

Teniendo en cuenta que el flujo volumétrico de

fase móvil por unidad de tiempo (Fo) es
constante, entonces:

Vr= Fo. tr

de forma análoga: V’r = Fo. t’r (Volumen de

retención reducido)

Así pues: V’r = Vr - Vm

  DEFECTO EN LA LINEA BASE
 Línea base: Es la porción del
cromatograma que registra la
respuesta del detector cuando
solamente sale fase móvil de la
columna.
 Ruido de la línea de base: Variación
instantánea de la respuesta del
detector, motivada por fluctuaciones
eléctricas, presencia de impurezas en
el gas acarreador, vibraciones
mecánicas de la base del equipo,
influencia de la presión de los gases
auxiliares, etc.
 Deriva de la línea base: Cambio
gradual de la línea base que la desvía
de su valor, normalmente horizontal.
La línea base es la respuesta del
detector en ausencia de soluto
Dimensiones de una columna
 DIMENSIONES DE LA COLUMNA de CG

Donde: dc es diámetro interior (mm o µm); df es el espesor de la película

(µm); ; L longitud de la columna mm
VELOCIDAD Y FLUJO DE FASE EN CG
CALCULO DE LA VELOCIDAD LINEAL
CONSTANTE DE REPARTO
ECUACIÓN RETENCIÓN
FACTOR DE CAPACIDAD
RELACION ENTRE TR Y K
RELACION ENTRE TR Y K

Ka < 1 elución es muy rápida, poca fiabilidad de detección.

Ka es entre 20-30 elución es muy lenta
Ka es entre 2-10 es ideal
PARÁMETROS CROMATOGRAFICOS
ÁREA y ALTURA
CÁLCULO PARA LA DETERMINACION DEL
ANCHO DEL PICO
 La longitud de una columna en la que el soluto experimenta un equilibrio
completo entre las dos fases

Eficacia de una separación cromatográfica

número de platos altura del plato teórico

teóricos (N) (H)

H = L/N

La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de

platos teóricos y menor la altura del mismo.
PLATO TEÓRICO MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
PLATO TEÓRICO MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
PLATO TEÓRICO MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
PLATO TEÓRICO MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

PLATO TEÓRICO EFECTIVO

 PODER DE SEPARACIÓN

 MIENTRAS MAYOR SEA No DE

PLATOS TEORICOS:
 MAYOR PODER DE SEPARACION
 SE PUEDEN SEPARAR MEZCLAS
COMPLEJAS
 SE PUEDEN SEPARAR
SUSTANCIAS PAREIDAS
ALTURA EQUIVALENTE DEL PLATO TEÓRICO

H=L/N
 Define la capacidad de un sistema cromatográfico para distinguir
entre dos componentes.
Es una función termodinámica que depende de las distribuciones
relativas entre las fases móvil y estacionaria.
Se expresa mediante el factor de selectividad o retención relativa:

2,1 = t'R,2 / t'R,1 = k'2 / k'1

Para que una separación sea posible, es necesario que los valores de
K´de los componentes de la mezcla sean diferentes.
Cuanto más elevado es el valor de  , mayor es la selctividad de la FE, y
más fáciles las separaciones
FACTOR DE SELECTIVIDAD
 Es un factor que se refiere a la capacidad de un sistema
cromatográfico para separar dos sustancias, teniendo en cuenta no
sólo la separación entre picos, sino también los anchos de la banda

Rs = 2(tR,2 - tR,1) / (wb,1 + wb,2)

 - 1 k2 N Selectividad (), se relaciona con los valores de

Rs = retención relativa y mide el poder discriminatorio del
 1 + k2 4 sistema cromatográfico.

Retención (k'), mide la fracción de eluato

presente en la FE y expresa el poder de
retención del sistema cromatográfico.

Eficacia (N), mide la estrechez relativa de

los picos mediante el número de platos
teóricos con que funciona la columna
FORMA DE DETERMINAR LA RESOLUCION EN UN
CROMATOGRAMA
COMPORTAMIENTO DE LOS PICOS VS RESOLUCIÓN
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA RESOLUCION
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA RESOLUCION
RESOLUCIÓN vs RETENCIÓN
RESOLUCIÓN vs SELECTIVIDAD
RESOLUCIÓN vs EFICIENCIA
TIEMPO TOTAL DE ANALISIS
 Objetivo
Conseguir picos bien definidos y separados en el menor
tiempo posible de análisis

variando las condiciones experimentales:

• velocidad de flujo,
• tamaño de partículas de soporte,
• temperatura de la columna,
• selección de fase móvil y estacionaria más adecuada,
• aumentando la longitud de la columna, etc

La ecuación de la resolución sirve de guía para elegir las condiciones que

permitan una buena separación: , K' y N pueden ajustarse más o menos
independientemente.
• modificar  y K’: variando la temperatura o la composición de las fases
• cambiar N modificando la longitud de la columna, y H variando el caudal de fase
móvil, el tamaño de partícula del relleno, la viscosidad de la fase móvil y el grosor
de la película de líquido adsorbido que constituye la fase estacionaria.
Aumento del número de platos de la columna mejora la
resolución:
longitud de la columna, temperatura, tipo de analito, caudal,
tamaño de la muestra, técnica de inyección, etc.
El resultado es un estrechamiento de las bandas con el
consiguiente aumento de la altura de las mismas; el tiempo de
retención prácticamente no se modifica.

 disminuir el tamaño de partícula del

relleno
 reducir la viscosidad de la fase móvil
líquida

Un aumento de K' generalmente aumenta la

resolución pero también el tiempo de elución.
Intervalo óptimo de valores de K’: 1 a 5.

Con fases móviles gaseosas, K' puede

mejorarse aumentando la temperatura
Con fases móviles líquidas, cambiando la
composición del disolvente.
 Un aumento en el factor de selectividad produce un
desplazamiento relativo de los máximos de las bandas,
con un rápido aumento de la resolución.
Los procedimientos para aumentar  sin modificar
significativamente K' son, por orden decreciente de
conveniencia:

1. cambiar la composición de la fase móvil incluyendo cambios en el pH

(en separaciones de ácidos o bases ionizables)
2. cambiar la temperatura de la columna, muy útil sobre todo en
cromatografía de cambio iónico
3. cambiar la naturaleza de la fase estacionaria: disponer de varias
columnas fácilmente intercambiables
4. utilizar efectos químicos especiales; incorporar a la fase estacionaria
una especia que forme complejos o interaccione de otra forma con uno
o más componentes de la muestra.
Ejemplo: usar un adsorbente impregnado con una sal de plata mejora la
separación de olefinas debido a la formación de complejos entre los iones
plata y los compuestos orgánicos insaturados.
INFLUENCIA EN EL FACTOR DE RETENCION

k’ óptimo entre 2 y 5 aproximadamente

EFECTO DEL SOLVENTE
EFECTO DE LA TEMPERATURA
FALLAS DE LA TEORIA DE LOS PALTOS

 LA TEORÍA DE LOS PLATOSS EXPLICA MUY BIEN TODO LO RELACIONADO

CON LOS PICOS GAUSIANOS, SIN EMBARGO FALLA AL MOMENTO DE

EXPLICAR EL ENSACHAMIENTO DE LOS PICOS.

TEORÍAS PARA EXPLICAR EL PROCESO
CROMATOGRÁFICO (ENSACHAMIENTO)
 Teorías para explicar el proceso
cromatográfico

1. Teoría clásica o estática

Teoría clásica o estática: propuesta en 1941, en la cual

se asimila la columna cromatográfica con una columna
de destilación.

2. Teoría cinética o dinámica

Teoría cinética o dinámica: propuesta en 1956 por Van

Deemter, que considera el proceso dinámico de la
separación.
Teoría clásica o estática

se considera un sistema estático en equilibrio, en el cual

el soluto recorre la columna mediante una serie de
equilibrios, cada uno de los cuales se alcanza, en toda su
extensión, en un segmento o porción de la columna,
llamado plato teórico.

se supone que la columna cromatográfica está dividida

en una serie de segmentos o platos teóricos, donde se
producen un equilibrio de distribución del soluto entre la
fase móvil y la estacionaria.

Af.móvil Af. est

Teoría clásica o estática

Dado que la separación se produce como consecuencia de estas

transferencias, la eficacia de la columna dependerá del número
de equilibrios que tiene lugar en el interior de la columna
durante la elución, es decir, depende del número de platos
teóricos que tenga la columna, N.

Cuanto más estrecho sea el plato teórico, mayor número de

ellos habrá para una longitud L de columna, por tanto, la
eficacia de la columna será inversamente proporcional a la
altura equivalente del plato teórico:

AEPT= H=L/N
Cuando los solutos viajan a través de la columna los picos se
ensanchan, y mas cuanto mas larga es la columna, por tanto
para determinar si una separación es posible tenemos que
tener en cuenta dos factores:

1. La diferencia en la velocidad de migración de los solutos, que

determina la posición de los picos en el cromatograma.
2. La velocidad finita que tarda en alcanzarse el equilibrio en
cada plato teórico, que traerá el ensanchamiento en las bandas
del cromatograma.

TEORÍA CINÉTICA O DINÁMICA.

TEORÍA CINÉTICA O DINÁMICA.

La eficacia de la columna para separar los componentes de la

muestra vendrá dada por dos factores:

1.La diferencia de la velocidad de migración de los solutos de

la mezcla, que origina la separación física entre los picos.

2. La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en

cada plato teórico que traerá consigo un ensanchamiento del
pico cromatográfico.
PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO

Mezcla de soluto
1+2+3+4+5
20 ul

V1+v2+v3+v4+v5 # 20 ul

W= tr (√N/4) Donde:W es el ancho de la banda

N es la eficiencia
tr es el tiempo de ret.
TEORÍA CINÉTICA O DINÁMICA.
PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO

ENSANCHAMIENTO DE BANDA INTRACOLUMNAR

PROCESO MULTIPASO
DIFUSION LOGITUDINAL
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA EN LA FM
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA EN LA FE

ENSACHAMIENTO DE BANDA EXTRACOLUMNAR

PRODUCIDO POREL DETECTOR

PRODUCIDO POR TUBERIAS
PRODUCIDOS POR EL VOLUMEN DE INYECCION.
PROCESO MULTIPASO

A
DIFUSION LONGITUDINAL
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA
PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO
EFECTO DEL TAMANO DE PARTICULA (HISTORIA)

1 mm----10 µM
 ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA EXTRACOLUMNAR

El ensanchamiento de la banda extracolumnar puede

medirse en función de la varianza del pico y son producidos
por tres fuentes:

1 Volumen de los componentes entre el inyector y la celda.

2 Volumen de inyección.
3 La constante de tiempo de detector.

  2
t2 columna   2tubos   2uniones   2 det ectores   2inyectores
ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA EXTRACOLUMNAR
ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA EXTRACOLUMNAR
ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA EXTRACOLUMNAR

Volumen del detector en la resolución de dos solutos.

ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA EXTRACOLUMNAR

Efecto de la constante de tiempo de detector

ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA EXTRACOLUMNAR

Efecto de la desviación éstandar de diferentes tubos

conectados al detector

INYECTOR ----COLUMNA -----DETECTOR

REFERENCIAS
GRACIAS POR SU ATENCIÓN