INTRODUCCION

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de

mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es
un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias
sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una
retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación
efectiva en función de los tiempos

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con
RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en
solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran
de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna.
Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la
muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza
de los compuestos a determinar.
 OBJETIVOS

 Conocer la cromatografía liquida como una técnica de separación de

mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella
intervienen.

 Identificar la incidencia del coeficiente de reparto entre la fase móvil y la

fase estacionaria.

 Analizar la influencia del solvente en la separación de cromatografía

liquida.

 Comprender los principios y procesos generales de la separación en la

cromatografía liquida.
 MARCO TEORICO

HISTORIA
La Cromatografía liquida fue la primera en aparecer
cronológicamente, utilizada por primera vez en
1903-1906 por el botánico ruso Mikhail Tsweett
para separar los componentes coloreados de un
extracto de plantas. Siguió trabajando con la
cromatografía en la primera década del siglo 20,
principalmente para la separación de pigmentos
vegetales como la clorofila, carotenos y xantofilas.
Dado que estos componentes tienen diferentes
colores que dio la técnica de su nombre. Nuevos
tipos de cromatografía desarrollados durante los
años 1930 y 1940 hicieron la técnica útil para
muchos procesos de separación.

La técnica de cromatografía desarrollada sustancialmente como resultado de

trabajo de Archer Porter Martin y Richard Laurence Willington Synge durante
los años 1940 y 1950.Se establecieron los principios y técnicas básicas de la
cromatografía de reparto. Y su trabajo alentó el rápido desarrollo de varios
métodos cromatograficos:

Cromatografía liquida de alta resolución. Desde entonces, la tecnología ha

avanzado rápidamente. los investigadores encontraron que los principales
principios de la cromatografía de Tsweett podrían aplicarse de muchas maneras
diferentes, dando lugar a las diferentes variedades de cromatografía se
describen a continuación. Los avances están mejorando continuamente las
prestaciones técnicas de cromatografía, lo que permite la separación de
moléculas cada vez más similares.
 Cromatografía liquida
Sistemas de cromatografía líquida

La cromatografía líquida es una técnica utilizada para separar los componentes

individuales de una muestra. Esta separación se produce mediante las interacciones
químicas o físicas de la muestra con las fases móvil y estacionaria. Debido a que
existen muchas combinaciones de fases móvil/estacionaria que se pueden emplear
cuando se separa una mezcla, hay varios tipos diferentes de cromatografías que se
clasifican según los estados físicos de esas fases. La cromatografía en columna
líquido-sólido, la técnica de
cromatografía más popular, incluye una
fase móvil líquida que filtra lentamente a
través de la fase estacionaria sólida, lo
que lleva los componentes separados.

Depende de bombas para pasar un

solvente líquido presurizado que
contenga la mezcla de muestra a través
de una columna llena de un material
adsorbente sólido. Cada componente de
la muestra interactúa de forma
ligeramente diferente con el material
adsorbente, generando distintas
velocidades de transporte para los
distintos componentes y provocando la
separación de los componentes a
medida que salen de la columna.

Hay muchos tipos de técnicas y sistemas de cromatografía diferentes que se

encuentran disponibles para una amplia gama de aplicaciones. Malvern Panalytical
ofrece una amplia gama de sistemas y detectores avanzados para cromatografías de
exclusión molecular (SEC). La cromatografía de exclusión molecular, también
conocida como cromatografía de permeación en gel (GCP) o cromatografía de
filtración en gel, se utiliza para la medición del peso molecular absoluto, tamaño
molecular, viscosidad intrínseca, ramificaciones y otros parámetros físicos.

Esta técnica separa las partículas en función del tamaño molecular (por el radio de
Stokes de una partícula). La SEC se utiliza principalmente para el análisis de
moléculas grandes como proteínas, polímeros y polisacáridos. La SEC no trabaja por
afinidad o interacción química, sino por el medio poroso de las columnas de la
cromatografía:
Métodos de cromatografía líquida

Método Abreviatura Mecanismo predominante

Líquido, sólido o
LSC Adsorción sobre la superficie
de adsorción

Reparto entre fases líquidas, una móvil y

Líquido LLC
la otra estacionaria.

Reparto y / o adsorción entre las fases

Fase enlazada BPC
móvil y enlazada.

Uso de la estructura de ligantes

Afinidad -- inmovilizados para unir bioselectivamente
la proteína deseada.

Selección de un método de cromatografía líquida

El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la muestra puede

ser muy útil en la selección de un método de cromatografía líquida. A continuación se
da una guía muy general para la selección de un método.
La cromatografía de absorción opera mejor en la separación por clases de
compuestos o para la separación de compuestos isoméricos. La técnica de
cromatografía líquido – líquido es mejor para la separación de homólogos. Los grupos
funcionales que son capaces de formar enlaces de hidrógeno fuertes se retienen
mucho en cromatografía de adsorción; sin embargo la CLL (Líquido – líquido)
proporciona una alternativa para la separación de estos compuestos; estas serán las
muestras que tienen polaridad media.
 Cromatografía Líquida (HPLC)

FUNDAMENTO

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y
una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl. La fase
móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase
móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-
covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas,
determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los
diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar.

APLICACIONES

Esta técnica está indicada para la separación de compuestos orgánicos semivólatiles.

Hidrocarburos Poliaromáticos (PAHs), Aminoácidos: OTA, Ácido Fólico, Herbicidas,
Vitaminas, Acido tenuazonico, Formaldehído…etc.

Rango de trabajo para muestras líquidas: µg L-1 - mg L-1

Rango de trabajo para muestras sólidas: µg Kg-1 - µg g-1

Tipo de muestras que se pueden analizar

Aguas, suelos, alimentos, extractos….etc (para cualquier tipo de matriz contactar con
el laboratorio).
 Clasificación de la cromatografía liquida

Cromatografía líquida ADSORCION (CLS) La fase estacionaria solida retiene a los

solutos por un doble efecto de adsorción física y y química. Las interacciones
implicadas son del tipo de fuerzas de Van der Waals
Disolventes: serie eluotrópica (ordenación según la capacidad relativa para desplazar
solutos de un adsorbente dado. Ej (gel de sílice) agua, metanol, acetona, ac. etilo,
cloroformo, benceno, tolueno, etc

Cromatografía de cambio iónico: los sólidos retiene a los solutos gracias a las
atracciones electrostáticas. la fase estacionaria solida lleva en la superficie cargas
electrostáticas fijas, que retienen contra iones móviles que pueden intercambiarse por
iones de la fase móvil.

Cromatografía de exclusión: la fase estacionaria es un material poroso, que

tiene a las moléculas en función de su tamaño. en ocasiones se denomina también
cromatografía de filtración sobre geles de permeabilidad en geles (GPC).

Fase estacionaria liquida

- cromatografía de reparto: la fase estacionaria es un líquido inmovilizado

sobre un material inerte solido que solo actúa de soporte.
- cromatografía de afinidad o de fases enlazadas. la fase estacionaria
generalmente es un polímero de tipo líquido inmovilizado sobre un sólido inerte
por enlaces covalentes
En ambos casos la separación se debe a equilibrios de distribución de los
solutos entre la fase móvil y estacionaria controlados por la diferente
solubilidad de los mismos en las distintas fases
.

tipo fase estacionaria fase movil

líquido-sólido sólido inerte como gel de sílice o

disolventes
alúmina

intercambio
soluciones
iónico resina cambiadora
acuosas

líquido-líquido líquido adsorbido en un soporte

líquido
sólido

gas-líquido película de líquido adsorbida sobre

gas
un soporte sólido
 Cromatografía líquido-sólido (columna)

Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala

preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o
alúmina dentro de una columna como las que se pueden ver en la figuras. La
elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente
pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de
presión (cromatografía flash). La
columna se prepara mezclando el
soporte con disolvente y se rellena la
columna poniendo en el fondo de
ésta un poco de algodón o lana de
vidrio, para evitar que la sílica o la
alúmina queden retenidas en la
columna y del disolvente se
enrasada hasta el nivel del soporte.
A continuación se introduce la
muestra por la parte superior de la
columna y se eluye con el disolvente
elegido, recogiéndose por lo general
en tubos de ensayo

Cromatografía líquido-sólido (capa fina)

La técnica de cromatografía en capa fina (TLC) es una de las más comunes

empleadas en un laboratorio de química orgánica. Entre otras cosas permite:

- determinar el grado de pureza de un compuesto

- comparar muestras

- realizar el seguimiento de una reacción

- controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna

La cromatografía en capa fina usa como fase estacionaria un sólido como gel de sílice
o alúmina conteniendo algún material que hace que se mantenga la fase estacionaria
sobre un soporte tal y como placas de vidrio de aluminio e incluso materiales
plásticos.
 Bibliografía

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/5.5Cromatografiadeliquidos_
7806.pdf

http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr
afia/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf

https://www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm

http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisis-aplicado-a-la-
ingenieria-quimica/contenidos/course_files/Diapositivas_tema_12.pdf

https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquida

http://analitek.com/cromatografia-de-liquidos-2/