(QMC 200) L Cromatografia

FACULTAD DE INGENIERIA - UMSA CURSOS BASICOS / LAB. QMC - 200 DOCENTE: ING.
ROBERTO PARRA
INGENIERIA PETROLERA UNIV.: BERNARDINO RAMOS MAQUERA GESTION: I / 2010
1. OBJETIVOS
 Conocer los diferentes tipos de cromatografía, para separar e identificar los diferentes
compuestos
 Calcular Rf de las diferentes sustancias que emplearemos para el laboratorio
 Determinar el disolvente adecuado para desarrollar el cromatograma.
2. FUNDAMENTO TEORICO
2.1. CROMATOGRAFIA
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la

cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un conjunto de técnicas basadas
en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una
mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Las técnicas cromatográficas1 son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste
en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase
estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla
interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la
fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de que los componentes hayan
pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede
depender de la concentración y del tipo de compuesto.
Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención
diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de
retención de cada componente de la mezcla.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:
 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados
posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las
cantidades de material empleadas son pequeñas.
2.2 CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS
Los métodos se clasifican dando en cuenta el estado de la fase móvil y el estado de la fase
estacionaria
FACULTAD DE INGENIERIA - UMSA CURSOS BASICOS / LAB. QMC - 200 DOCENTE: ING. ROBERTO PARRA
Fase Fase Técnica Proceso

estacionaria móvil cromatografica cromatografico
Capa fina Adsorción
Sólida Líquida Columna I. Iónico
Exc. Molecular
Gas Columna Adsorción
Papel
Líquida Líquida Capa Fina Partición
Columna
Gas Columna Partición
2.1.1 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Las cromatografías son un grupo de técnicas de separación selectiva de moléculas, en las que los
componentes de una mezcla compleja de componentes pueden ser identificados y/o purificados.
Existen varios tipos de cromatografías, según los criterios que se usan para hacer los análisis, pero
todas consisten de una fase estacionaria y una móvil.
En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la
fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más
rápido que A. Existen muchos tipos de cromatografía de columna. En el laboartorio de hoy veremos tres tipos de ellas
2.1.2. CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL.
En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una cama de esferas con poros
de un tamaño dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las
moléculas de igual o menor tamaño que el poro entran a las esferas entras que las moléculas más
grandes pasan rápidamente por la columna. Las moléculas de tamaño intermedio pueden entrar las
esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las moléculas salen en orden de tamaño por el eluído.
Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están coloreadas, al hacer esta
cromatografía en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qué fracciones contienen las
muestras de interés, las cuales suelen ser proteínas. Estas pruebas pueden ser mediciones
fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con
las muestras,podemos hacer un "profile" de elución con concentración en con concentración en Y y
el volumen de elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene
es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Las moléculas más grandes salen
inmediatamente después.
El material que se escoja para la fase estacionaria dependerá del tipo de muestra que estemos
corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamaño. En nuestro caso usaremos Sephadex
G-75, que separa moléculas entre 3,000 y 70,000 daltons. Moleculas mayores de 70,000 no estrarán
a los poros de las esferas.
2.1.3. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica. La fase estacionaria
presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las moléculas de igual carga salen con el
amortiguador. Las moléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos
grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro de
potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad, o
de un solo paso, echando la solución de mayor concentración de sal primero. Al subir la
concentración poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la
columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va compitiendo con la proteína
por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende.
La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catiónico) o positiva (intercambio aniónico).
El tipo de empaque dependerá de qué queremos aislar. En este tipo de columna el pH es importante
porque puede alterar la carga de la columna.
En nuestro caso usaremos una mezcla de dos proteínas en una columna de intercambio catiónico y la
eluiremos en un solo paso, con 1M KCl.
2.1.4. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Esta es una cromatografía de separación de mezclas proteicas donde se cumple el siguiente proceso
las bolas de gel están recubiertas de un ligamento por el que tiene alguna afinidad alguna de las
proteínas es retenida en la superficie de las bolas eluyendose las demás.
Para eluir la proteína retenida por afinidad se suele aumentar la fuerza iónica de la solución de
solvente o incluir en este el ligamento soluble a alta concentración de forma que compita con el que
esta unido a las bolas de gel por la unión a la proteína.
2.1.5. CROMATOGRAFIA EN PAPEL
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis
cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de
equipamiento.
La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se
deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solvente. Luego el
disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de
papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase
móvil en el fondo.
Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el
papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las
manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel
se somete a procesos de revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del solvente y la del
papel de filtro.
2.1.6. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente

mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un
adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para
aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso
también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un
componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma
que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos
(en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que
se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor.
Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es
simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para
fines analíticos
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
 Eter de petróleo.  Eter dietílico.  Ciclohexano.

 Acetato de etilo.  Tetracloruro de carbono.*  Piridina.
 Benceno.*  Etanol.  Cloroformo.*
 Metanol.  Diclorometano.  Agua.
 Ácido acético.
3. MATERIALES
 Tubos de ensayo  Vaso de precipitado

 Mortero  Gradillas
 Papel de filtro  Tijeras
 Espátula  Pipeta
 Proveta  Columna con sephadex
 soporte  pipetas de tansferencia
 Tubos y soportes
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. PROCEDIMIENTOS
4.1.1. CROMATOGRAFIA EN PAPEL

AZUL NARANJA ROJO
DE DE DE
METILO METILO METILO
SOLVENTES MAS USUALES

 AGUA
 ALCOHOL ETILICO
 HEXANO
 CLOROFORMO
 BENCENO
 MEZCLA DE ETANOL Y AGUA
 MEZCLA DE HEXANO Y
BENCENO
4.1.2. CROMATOGRAFIA DE ADSORCION
.
5. DATOS, CALCULOS Y RESULATADOS

5.1 DATOS
5.1.1 DATOS DE LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Para el etanol:
TABLA Nº 1
Distancia recorrida Distancia recorrida
Sustancia por el disolvente  cm por la sustancia  cm
Azul de metilo 9.6 6.6
Naranja de metilo 8.8 8.8
Rojo de metilo 10.7 3
Para el etanol mas agua:

TABLA Nº 2
Rojo de metilo 6.8 5.3
Para el hexano:
TABLA Nº 3
Azul de metilo 12.1 0
Naranja de metilo 12.8 0
Para el mejor disolvente (ETANOL):
TABLA Nº 4
Sustancia por el disolvente  cm  por la sustancia  cm
A. M. 1.6
Mezcla 7.5 N. M. 5.4
R. M. 3.4
5.1.2 DATOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Para el mejor disolvente (ETANOL):
TABLA Nº 5
Sustancia por el disolvente  cm  por la sustancia  cm
A. M. 0.2
Mezcla 4.5 N. M. 3.6
R. M. 3.6
5.2 CALCULOS Y RESULATADOS OBTENIDOS

5.2.1 PARA LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Etanol:
Etanol mas agua:
Hexano:
Para la mezcla con el etanol:
5.2.2 PARA LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
6. CONCLUSIONES
 Se pudo apreciar los distintos tipos de cromatografía como la cromatografía en papel y la

cromatografía de adsorcion.
 Se pudo apreciar los distintos tipos de factor de retardación en la cual se pudo apreciar
de que el que tiende un factor de retardación relativamente considerable es el etanol.
 Concluido el experimento pudimos apreciar de que en la cromatografía de adsorcion el que
esta en la parte del azúcar es la clorofila la cual se manifiesta en color verde en la parte de la
carbonato de calcio se pudo observar que se encuentra la xantofila la cual se manifiesta en
un color verde amarillo por ultimo en la parte de la alumina se encuentra el caroteno que es
de color naranja que se podría indicar que proviene de la zanahoria.
7. CUESTIONARIO
1. Cual es el origen de los colores de la tinta en los marcadores? Esta hecha de varios colores o
solamente de color? Como se obtiene el color que observamos en la tinta utilizada a partir de
los distintos colores que la componen?
RESPUESTA. Se puede observar en la naturaleza que no solamente un color es de mismo color

esta resulta de varias combinaciones el origen de los colores de la tinta de marcador es en
distintos lugares se encuentra una tierra de color la cual da un color los colores que abundan son
rojo café amarillo y azul y las demás resultan la combinación de las mismas.
2. utiliza los mismos componentes para obtener diferentes colores de tinta siesta fuese así estos
colores estos colores o manchas deberán mostrar una idéntica totalidad moverse la misma
distancia relativa con respecto al agua o al solvente utilizado.
RESPUESTA. Se utiliza tres colores primarios el rojo, amarillo, azul las demás resultan de la
combinación de la misma pero en diferentes cantidades de la misma pero para el negra se debe
utilizar al carbono la cual hará variar la distancia respecto al negro
3. ¿Qué ocurre si el agua es alterada adicionalmente algo como sal de mesa causa algún efecto
en el movimiento de los colores
RESPUESTA. Claro que si porque el cloruro de sodio tiene una distinta polariza que del agua
esto causa el retardo del movimiento de la mancha.
4. Indicar la respuesta correcta en cromatografía de capa fina
a. El valor de Rf esta comprendido entre 0 y 1.

b. El Rf es independiente de la fase móvil (eluyente) empleada.
c. El Rf es constante para cada grupo funcional.
d. El valor de Rf da información cuantitativa del compuesto.
5. La separación por extracción líquido-líquido consiste en:

a. Separar solutos que no producen una respuesta similar a la del compuesto a analizar.
b. Separar un soluto mediante su distribución entre dos fases miscibles entre si.
c. Separar los componentes de una mezcla por medio de varios disolventes de distinta polaridad.
d. Separar solutos de una mezcla mediante volúmenes iguales de un disolvente.
6. Indíquese la respuesta NO correcta:

a. La separación por volatilización se basa en la modificación del estado físico de la muestra.
b. La destilación fraccionada permite separar mezclas cuyo coeficiente de partición entre la fase
líquida y vapor no difiere considerablemente.
c. La separación por precipitación es una técnica útil para la separación de polímeros.
d. La separación por precipitación se basa en las diferentes solubilidades entre las sales que pueden
formar los analitos y los compuestos interferentes.
7. Indíquese la respuesta correcta:

a. En la elusión en cromatografía, la muestra se añade modo continuo a la columna hasta la
separación completa de sus componentes.
b. La cromatografía de permeabilidad sobre gel se basa en un fenómeno de filtración molecular en el
que influyen el tamaño y forma de las moléculas.
c. En la cromatografía de intercambio iónico, se intercambian cationes de la muestra con
aniones de la resina iónica que constituye la fase estaci0onaria.
d. La cromatografía de permeabilidad sobre gel es un tipo de cromatografía sólido-líquido.
8. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos, clorofila a, clorofila
b y xantofila. Indicar que pigmento corresponde a cada banda.
RESPUESTA. Para la clorofila el pigmento es de color verde y para la xantofila es de color
amarillo.
9. ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?

RESPUESTA. Porque la clorofila se disuelve fácilmente en el éter etílico y se tiene un factor de
retención mayor a la xantofila y al caroteno.
10. ¿Qué pigmentos son los mas abundantes?

RESPUESTA. El pigmento mas abundante es el verde de la clorofila.
11. Por encima de las clorofilas aparece mas de una banda, ¿Qué significado tiene?
RESPUESTA. Las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de
la mezcla en bandas o zonas, que se localizan a lo largo de la columna.
8. BIBLIOGRAFIA
Lydia Galagovsky Fundamentos teorico Practicos para laboratorio EUDEBA

FIESER, LOUIS EXPERIMENTOS ORGANICOS Barcelona 1967 ED. Reverté
PAVIA, Donald, Lampman Gary y Kriz S. George
“QUÍMICA ORGANICA EXPERIMENTAL”
ED, Universitaria de Barcelona España 1976.
INDICE
1. OBJETIVOS 3
2. FUNDAMENTO TEORICO 3
2.1. CROMATOGRAFIA 3
2.2 CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS 3
2.1.1 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA 4
2.1.2. CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL. 4
2.1.3. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO 4
2.1.4. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 4
2.1.5. CROMATOGRAFIA EN PAPEL 5
2.1.6. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 5
3. MATERIALES 6
4. PARTE EXPERIMENTAL 7
4.1. PROCEDIMIENTOS 7
4.1.1. CROMATOGRAFIA EN PAPEL 7
4.1.2. CROMATOGRAFIA DE ADSORCION 8
5. DATOS, CALCULOS Y RESULATADOS 8
5.1 DATOS 8
5.1.1 DATOS DE LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL 8
5.1.2 DATOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 8
5.2 CALCULOS Y RESULATADOS OBTENIDOS 9
5.2.1 PARA LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL 9
5.2.2 PARA LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 9
6. CONCLUSIONES 9
7. CUESTIONARIO 9
8. BIBLIOGRAFIA 11

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INGENIERIA PETROLERA UNIV.: BERNARDINO RAMOS MAQUERA GESTION: I / 2010

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

2.2 CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

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Fase Fase Técnica Proceso

2.1.2. CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL.

2.1.3. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

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2.1.4. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

2.1.5. CROMATOGRAFIA EN PAPEL

INGENIERIA PETROLERA UNIV.: BERNARDINO RAMOS MAQUERA GESTION: I / 2010

2.1.6. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

 Eter de petróleo.  Eter dietílico.  Ciclohexano.

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 Tubos de ensayo  Vaso de precipitado

 soporte  pipetas de tansferencia

4.1.1. CROMATOGRAFIA EN PAPEL

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AZUL NARANJA ROJO

METILO METILO METILO

SOLVENTES MAS USUALES

4.1.2. CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

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5. DATOS, CALCULOS Y RESULATADOS

Para el etanol mas agua:

5.1.2 DATOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

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5.2 CALCULOS Y RESULATADOS OBTENIDOS

Etanol mas agua:

Para la mezcla con el etanol:

5.2.2 PARA LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

 Se pudo apreciar los distintos tipos de cromatografía como la cromatografía en papel y la

INGENIERIA PETROLERA UNIV.: BERNARDINO RAMOS MAQUERA GESTION: I / 2010

RESPUESTA. Se puede observar en la naturaleza que no solamente un color es de mismo color

4. Indicar la respuesta correcta en cromatografía de capa fina

a. El valor de Rf esta comprendido entre 0 y 1.

5. La separación por extracción líquido-líquido consiste en:

INGENIERIA PETROLERA UNIV.: BERNARDINO RAMOS MAQUERA GESTION: I / 2010

d. Separar solutos de una mezcla mediante volúmenes iguales de un disolvente.

6. Indíquese la respuesta NO correcta:

7. Indíquese la respuesta correcta:

9. ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?

10. ¿Qué pigmentos son los mas abundantes?

Lydia Galagovsky Fundamentos teorico Practicos para laboratorio EUDEBA

INGENIERIA PETROLERA UNIV.: BERNARDINO RAMOS MAQUERA GESTION: I / 2010

2.2 CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS 3

2.1.1 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA 4

2.1.2. CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL. 4

2.1.3. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO 4

2.1.4. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 4

2.1.5. CROMATOGRAFIA EN PAPEL 5

2.1.6. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 5

4.1.1. CROMATOGRAFIA EN PAPEL 7

4.1.2. CROMATOGRAFIA DE ADSORCION 8

5. DATOS, CALCULOS Y RESULATADOS 8

5.1.1 DATOS DE LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL 8

5.1.2 DATOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 8