Unidad II.

Cromatografía
CROMATOGRAFIA

Dra J. Xiomara K Perales Sánchez Abril del 2021.

 Carotenos
Feofitina

Clorofila A
Éter de petróleo

Clorofila B

Luteina

Vidaxantina
CaCO3
Neoxantina
La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos
físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases
mutuamente inmiscibles:
 La FE y la FM
 La muestra en la FM es transportada por la FE
 Los analitos experimentan interacciones
repetidas (repartos) entre la FM y la FE.
 En una FM y FE los analitos se separan
gradualmente en bandas en la FE.
 Al final los componentes separados
emergen en orden creciente de interación
 El componente menos retardado emerge
primero, el retenido eluye al final.

 El reparto entre las fases aprovecha las

diferencias entre las prop. físicas y/o
químicas de los componentes de la
muestra.
La selección de las fases depende de la naturaleza química de la muestra y el
proceso que se lleve a cabo :

PROCESO FASE MOVIL FASE ESTACIONARIA

Reparto (Liquido-Liquido) Disolventes orgánicos Sólido desactivado

saturados con agua
Adsorción (Liquido-sólido) Solventes no polares Alúmina o geles de sílice

Exclusión (Filtración en gel) Agua o compuestos Partículas esféricas de un

orgánicos polímero poroso que
adsorbe fácilmente agua y
otros solventes.
Intercambio iónico Agua o compuestos Resinas, geles o celulosa
orgánicos de intercambio iónico
Afinidad solución sin ligando , solución Ligando unido a soporte
con ligando libre sólido insoluble
Cromatografía en columna
 Preparación de la muestra
• La muestra se aplica en forma líquida. Si es necesario se diluye y se
aplica directamente.
• Si la muestra es sólida, se disuelve en un pequeño volumen de
disolvente. El disolvente puede ser el mismo que se utiliza como
fase móvil u otro que sea miscible con ella.
• Los extractos de tejidos biológicos requieren una purificación
preliminar:
o Los lípidos se extraen con disolventes orgánicos
o las proteínas pueden precipitarse con alcohol
o Las sales con resinas de intercambio iónico
 EMPAQUETADO
COLUMNA

ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES

APLICACIÓN
MUESTRA
1.- ELUCION. Es el proceso mediante el cual un solvente fluye a través de la columna produciendo la
separación de los componentes de la mezcla.

 Eluyente (efluente): Es la fase móvil portadora de la muestra.

 Eluato: Término con el que se define la salida del eluyente.

Dependiendo de los solventes utilizados se clasifica en:

a) Elución simple: Es la que se realiza con un solo solvente y es el mismo con el que se empacó la
columna.

b) Elución fraccionada: Se comienza el desarrollo con un solvente o mezcla de solventes, cuando se ha

logrado eluir una parte de los componentes de la mezcla, se completa la separación con otro
solvente o mezcla de solventes, los cuales tienen que tener mayor poder elutivo que los usados
primero.

c) Elución gradual o por gradiente: En este caso el solvente se modifica en forma gradual, (escalonada)
aumentando lentamente el poder de elución. Cambia en forma continua. Este procedimiento es
apropiado para la separación por intercambio iónico. (usando mezclas de agua y solventes orgánicos)
2.- DESPLAZAMIENTO. Se coloca una pequeña cantidad de muestra en la parte
superior de la columna, agregando un solvente con poca afinidad por la fase
estacionaria, después se añade otro solvente con mayor afinidad por la fase
estacionaria que desplazará a los componentes de la FE y así sucesivamente de tal
forma que el solvente que se agrega desplace al anterior y se producirá una
competencia de la fase estacionaria por el solvente y el soluto.

3.- ANÁLISIS FRONTAL. En ésta técnica en lugar de utilizar un

solvente como eluyente, la propia mezcla se agrega
continuamente a la columna hasta que ésta se satura.
Esta técnica es útil para determinar el número de componentes
que existen en una mezcla y la presencia de huellas de impurezas
 Para detectar, aislar e identificar los componentes separados se
puede emplear diferentes procesos:
1.- Extracción del relleno. Se eluye durante un tiempo apropiado y después con un
émbolo metálico se saca de la columna el adsorbente con mucho cuidado para evitar
que se desmorone.
Si los componentes:

 son coloreados se deja un tiempo para que se evapore el disolvente, se corta en rodajas
las zonas que ocupan los componentes y se extraen de cada rodaja con un disolvente
apropiado y se analiza el extracto.

 no son coloreados, se aprieta el cuerpo del adsorbente con una tira de papel para que
adsorba un poco del disolvente, se seca y se revela, para que nos indique la posición de
cada uno de los componentes. El papel se coloca de nuevo al lado del relleno y se localiza
la posición de los componentes. Se cortan en rodajas extrayendo cada componente con
un disolvente apropiado. Posteriormente los extractos se identifican y cuantifican.
2.- Recolección de volúmenes. Se recolectan volúmenes
iguales de eluato durante la separación y se analizan
por otros métodos adecuados, determinándose dónde
se encuentran los componentes de la muestra. La
recolección se puede hacer en forma manual o con
recolectores automáticos.

3.- Análisis continúo: Consiste en conducir el

eluyente a través de un aparato que mide
alguna propiedad de los componentes
separados. Se bombea el eluyente a través de
un detector, el cual genera una señal en
respuesta al componente y los resultados se
representan en un gráfico. Las señales
permitirán localizar las fracciones que contienen
material utilizable.
Adsorbentes más comunes para cromatografía en capa fina.
ADSORBENTES TIPO DE MUESTRAS A SEPARAR

ALUMINA (óxido de aluminio): ácida, Compuestos neutros, alcalinos,

básica o neutra. hidrocarburos policiclicos, alcaloides
aminas, vitaminas liposolubles

GEL DE SILICE: Para cromatografia de Aldehidos, cetonas, alcaloides, azucares,

adsorcion o partición fenoles, esteroides, terpenos, acidos
grasos y aminoácidos

CELULOSA MICROGRANULAR Para Sustancias hidrófilas

cromatografia de reparto

CELULOSA DE INTERCAMBIO IONICO Aniones y cationes

 Para la selección del adsorbente tomar las siguientes consideraciones:

a) Polaridad
b) Tamaño de partícula (menor de 40 micrómetros)
c) Área Superficial
d) Homogeneidad
e) Adherencia
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

Eter de petróleo. Etanol.

Eter dietílico. Cloroformo.*
Ciclohexano. Metanol.
Acetato de etilo. Diclorometano.
Tetracloruro de carbono.* Agua.
Piridina. Ácido acético.
Benceno.*
*compuestos cancerígenos
PRUEBA DEL PODER ELUTIVO:
Consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un
tubo capilar distintos eluyentes sobre de cada muestra. Apreciando cuales son los
eluyentes más efectivos para realizar la separación
Factores que influyen en una separación por cromatografía
de capa fina/ papel
Temperatura: A menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase
estacionaria.

b) Corrientes de aire. Debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.

c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o agentes
plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas deben limpiarse
corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar
completamente antes de aplicar la muestra.

d) Pureza de los disolventes

Factores que influyen en el grado de separación de una mezcla en cualquier
técnica cromatográfica:

1. Velocidad de flujo del solvente

2. Solubilidad de las sustancias en el solvente
3. Efectos de fraccionamiento (partición)
4. Efectos de adsorción

Los dos primeros son responsables de la movilización de los componentes a

través de la FE y los dos últimos del retardo del movimiento .

Por lo tanto los factores primordiales que determinan la separación

cromatográfica son la combinación de la solubilidad y el flujo del solvente.