Fase normal Fase inversa

OH Sup. apolar CH3 Cromatografía

Sup. polar OH de la fase CH3
de la fase OH CH3
estacionaria CH3
estacionaria OH
C CH3
OH
CH3
OH
ROMATOGRAFIA
OHEluyente CH3
OH Eluyente
OH apolar CH3
polar

Polar Polaridad Apolar

media
 ¿Qué es?
La cromatografía es una técnica de separación de los componentes de una mezcla, la
separación cromatográfica se basa en la diferencia de la velocidad de migración de los
componentes de la mezcla entre dos fases, una fase estacionaria y una fase móvil, de tal
manera que durante la separación, los componentes de la mezcla se distribuyen entre las
dos fases, al interaccionar entre si. (Thompson 1977; Skoog & West, 1989)

 ¿Para qué sirve?

La cromatografía es una técnica en donde se lleva a cabo la separación de

compuestos con el propósito de identificar, cuantificar o purificar cada uno de los
componentes de una mezcla de solutos, basándose en las velocidades con las que se
mueve cada soluto a través de un medio poroso arrastrado por un solvente, una mezcla
de solventes o por gas13.

 ¿Cómo se divide la Cromatografía?

Como ya se mencionó, la cromatografía es una separación entre dos fases, una

de ellas es la fase estacionaria, que es el soporte sobre el cual se desarrollan ciertas
acciones fisicoquímicas como la adsorción, disolución, o reacciones químicas como el
intercambio iónico. Por lo que existen diferentes divisiones en la práctica para la
cromatografía, según el tipo de separación cromatográfica la cromatografía puede
dividirse como se observa en la tabla 1.

Tabla 1. Clasificación de las separaciones cromatográficas

Tipo de Fase Fase Descripción
cromatografia Móvil Estacionaria
Gas- líquido Gas Líquido Adsorbida sobre un sólido poroso sostenido en un tubo o
adsorbida en la superficie interna de un tubo capilar
Gas – sólido Gas Sólido Adsorbida en un sólido poroso soportado en una columna
tubular
Partición o de Líquido Líquido técnica en donde una fase estacionaría forma una película
reparto líquida delgada en la superficie de sólido, el soluto se
equilibra entre este líquido estacionario y uno móvil
Adsorción Líquido Sólido Se utiliza una fase estacionaría sólida Sostenida en una
columna tubular y una fase móvil líquida o gaseosa. El
soluto puede adsorberse en la superficie de las partículas
sólidas. El equilibrio entre el estrado adsorbido y la solución
es la causa de la separación de las moléculas del soluto.

1
 Cromatografía

Continuación......
Tipo de Fase Fase Descripción
cromatografia Móvil Estacionaria
Papel Líquido solido La separación se realiza sostenida en los poros de un papel
grueso
Capa delgada Líquido solido La separación se realiza sobre un sólido finamente dividido,
sostenido sobre una placa de vidrio, eventualmente un
líquido puede adsorberse sobre las partículas.
De exclusión Líquido solido La fase estacionaria es un gel sostenido entre los poros o
molecular o de intersticios de un polímero, en esta técnica las moléculas se
filtración en gel separan por su tamaño.
Intercambio iónico Líquido Solido ionico Se basa en el equilibrio entre iónes del soluto y solvente en
donde los sitios fijos cargados de la fase estacionaría cuentan
con intercambiadores aniónicos (grupos con carga positiva
unidos covalentemente) los cuales retienen a los aniones del
soluto y con intercambiadores catiónicos (grupos con carga
negativa) retienen a los cationes del soluto.

Según las técnicas analíticas desarrolladas sobre la base de los desarrollos

tecnológicos existen también otras clasificaciones como:

La cromatografía de gases (GC)

Esta cromatografía se basa en que un líquido volátil o un soluto gaseoso son arrastrados
por una fase móvil gaseosa que circula sobre un líquido estacionario que recubre un
soporte sólido o sobre una superficie sólida absortiva.

La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)

Este tipo de cromatografía se utiliza para separación de compuestos que no son lo
suficientemente volátiles o no tienen bastante estabilidad térmica para la cromatografía
de gases. Se utilizan columnas empacadas grandes con fase móvil suministrada por
gravedad o por bombeo a baja y alta presión en esta ultima se utilizan columnas
pequeñas que contienen un menor tamaño de partícula de empaque gel de sílice o
alúmina.

Cromatografía de permeación en Gel (GPC)

Este tipo de cromatografía es muy similar a la cromatografía de líquidos o HPLC, pues
se emplean sistemas de detección parecidos, pero la separación se realiza en columnas
tubulares empacadas con polímeros porosos que soportan un gel de polaridad especifica.

A continuación se mencionan más específicamente las características de las

cromatografías según la ultima clasificación.

2
 Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE GASES

Este tipo de cromatografía se basa en la diferencia de velocidades de migración de los

componentes de una mezcla entre dos fases; una estacionaria y una móvil, donde la fase
móvil es un gas, de tal manera que cada componente es selectivamente retenido por la
fase estacionaria. La cromatografía de gases se utiliza para separar, identificar y
cuantificar cualquier material que contenga una presión de vapor apreciable (1 a 1000
mm Hg) a una temperatura de operación de la columna (medio de separación).

En esta cromatografía un soluto gaseoso (vapor de un líquido volátil) es

transportado por una fase móvil gaseosa. De acuerdo al tipo de fases estacionaria se
clasifica en dos:

1) La fase estacionaría suele ser un líquido no volátil que recubre el interior de la

columna o un soporte sólido de grano fino. Esta forma más común de cromatografía de
gases se llama cromatografía de reparto o de partición gas – líquido.

2) En ocasiones se utilizan como fase estacionaria partículas sólidas sobre las que el
soluto puede adsorberse. En este caso la técnica se denomina cromatografía de
adsorción gas – sólido.

LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA.

El proceso de separación se lleva a cabo al introducir la muestra a una columna,

observan la figura 1, se puede apreciar este proceso en el que las moléculas de los
diferentes componentes de una mezcla se separan gracias a la diferencia en la velocidad
de migración de estos dentro de la fase estacionaria, lo que puede suceder debido a su
composición química y a las interacciones de las moléculas de los analitos con la fase
estacionaria.

Columna
flujo de gas
Fase móvil
Fase estacionaria

Detector

Figura 1. Separación cromatográfica.

3
 Cromatografía

INSTRUMENTACIÓN

Los componentes básicos de un cromatógrafo de gases han sido los mismos desde que
apareció el primer cromatógrafo comercializado, estos son el sistema de introducción
de la muestra, el horno de la columna y los detectores (Wenzel, 1990), aunque poco a
poco se han mejorados los equipos para cromatografía de gases, estos tres elementos
forman parte fundamental de cualquier cromatógrafo de gases.

¿Cuáles son las partes de un cromatógrafo de Gases?

En general las partes básicas de un cromatógrafo de gases son:

1.- Gas de arrastre (Cilindro).

2. - Regulador de presión y válvulas de control de flujo
3.- Sistema de introducción de la muestra o Inyector
4. – Horno que contiene la Columna o columnas
5. - Detectores
6. – Procesador de datos (Integrador, registrador o PC)

5
2 6
Integrador,
3 Registrador o
1 PC

Figura 2. Esquema de un cromatógrafo de gases.

¿Qué pasa dentro de un cromatógrafo de Gases?

1. Una muestra de líquido volátil es inyectada a través de una septa de goma (un disco
delgado) en un puerto de inyección caliente, recubierto de vidrio o metal, donde se
vaporiza la muestra. La muestra gaseosa puede inyectarse con una jeringa de cierre
hermético o a través de una válvula de muestreo de gas.

2. La muestra es arrastrada rápidamente hacia la columna del gas portador inerte (que
suele ser He, N2, Ar o H2), que actúa como fase móvil. Después de pasar por la
columna que contiene la fase estacionaría, los solutos son separados y fluyen por un
detector, cuya respuesta se visualiza en un registrador o una computadora.

3. No es necesario que la temperatura de la columna sea mayor que el punto de

ebullición de todos los solutos. Sólo debe ser lo bastante elevada para que cada
soluto tenga suficiente presión de vapor a fin de ser eluido en un tiempo razonable.

4
 Cromatografía

4. El detector se mantiene a mayor temperatura que la columna, de modo que en esta

todos los solutos están en fase gaseosa. Los solutos que salen del cromatógrafo de
gases pueden colectarse para su identificación o enviarse directamente a un
espectrómetro de infrarrojo o de masas para el análisis inmediato de cada pico
cromatográfico.

5. Para colectar cantidades de soluto del orden de los microlitros, en el puerto de salida
del cromatógrafo se inserta en un tubo de vidrio en U, el fondo de ese tubo se enfría
con hielo seco o nitrógeno líquido para condensar el soluto.

Para comprender mejor el funcionamiento de un cromatógrafo de gases se describen a

continuación sus partes por separado

GAS DE ARRASTRE

El Cromatógrafo de Gases emplea gas como fase móvil para este tipo de cromatografía,
las características que este gas debe reunir básicamente son las siguientes:

•Inerte con respecto a la muestra y a la fase estacionaria

•Capaz de minimizar la difusión gaseosa.
•De fácil disponibilidad y con un alto grado de pureza
•Adecuado al tipo de detector que se emplea.

En base a esto los gases más usados en cromatografía de Gases son el Helio, Nitrógeno,
ya que son inertes, tienen baja difusión gaseosa y se encuentran fácilmente con altos
grados de pureza como 99.999%, aunque también se usa la mezcla Argón-metano
(95-.5%). La velocidad para un flujo óptimo se puede determinar experimentalmente
empleando la ecuación de Van Deempter.

La velocidad de flujo más eficiente, es el mínimo de la altura equivalente de un plato

teórico (HEPT) o bien, al máximo del número de platos determina gracias a la ecuación
de Van Deempter (ver figura 3).

HEPT

Velocidad de flujo

Figura 3. Plano de Van Deempter para la selección de la velocidad de flujo óptimo

del gas de arrastre

5
 Cromatografía

REGULADOR

Un regulador de presión se emplea para uniformar la entrada del gas en la columna. Es

importante que el regulador sea el adecuado para cada tipo de gas y además que sea
apropiado para gases de alta pureza.

SISTEMAS DE MUESTREO

El sistema de muestreo o inyector, es el lugar donde se introduce la muestra al

cromatógrafo de gases y en el cual la muestra debe evaporarse de inmediato y
combinarse con el gas de arrastre. Las muestras, que pueden analizarse en un
cromatógrafo de gases, pueden encontrarse en estado liquido, sólido o gaseoso por lo
cual las formas de ingresar la muestra a la columna cromatográfica son diferentes, los
inyectores son un puerto de ingreso de la muestra a la columna, típicamente son un tubo
con un inserto de vidrio intercambiable, donde se evapora la muestra después de ser
ingresada, cuenta con una septa que funciona como un sello, y esta rodeado por un
bloque de calentamiento que favorece la evaporación de sustancias de alto punto de
fusion, algunos inyectores cuentan con una forma de dilución de la muestra evaporada
llamada split (división) que fragmenta la muestra. Ver figura 4. Después de que la
muestra ha sido evaporada ingresa a la columna cromatográfica que es donde se realiza
la separación.

Purga del split

Columna

Figura 4. Diagrama de un puerto de inyección (Basado en Analytical Chemistry, 1994)

Debido a la composición o estado de las muestras, estas pueden caracterizarse como:

6
 Cromatografía

Jeringa o
dispositivo de
a) Muestras líquidas. toma de muestra
Se emplea una jeringa con punta, se perfora con ella la septa.

b) Muestras gaseosas.
Se emplean válvulas muestreadoras especiales con el empleo de circuitos muestreadores
de volúmenes específicos, o bien con jeringas especiales de precisión.

c) Muestras sólidas.
Se recurre a disolventes o se emplean jeringas especiales en forma de espátulas.

DISOLVENTES

Las características de un disolvente para ser empleado en cromatografía de gases son:

•Un buen disolvente absoluto para los componentes de la muestra, si la solubilidad es

baja, los componentes eluyen rápidamente y la separación es pobre.

•Ser un buen disolvente diferencial para los componentes de la muestra.

•No volátil, la presión de vapor 0.01 a 0.1 mide Hg a la temperatura de operación

razonable para la vida de la columna.

•Térmicamente estable, la inestabilidad puede ser promovida por el soporte con la

influencia de la temperatura.

•Químicamente inerte con respecto a la muestra.

COLUMNAS

Las columnas son el corazón se un sistema cromatográfico, pues en ella se realiza la

separación, principal objetivo de la técnica de la cromatografía, existen variedad de
columnas cromatográficas que se clasifican de acuerdo a su diámetro interno, material
de elaboración y a la fase estacionaria que contienen. Una clasificación general de las
columnas puede ser en dos ramas:

a) Columnas empacadas
Las columnas empacadas de acero inoxidable o vidrio tienen diámetros de 3 a 6 mm y
de 1 a 5 m de longitud. La columna se llena con un soporte de grano fino recubierto de
un líquido no volátil como fase estacionaria, aunque el sólido mismo puede ser la fase
estacionaria. Para trabajos preparativos, el espesor de la fase estacionaria se incrementa
para dar más cabida a la muestra y se prefieren las columnas de mayor diámetro (figura
5).

7
 Cromatografía

b) Columnas capilares
Las columnas tubulares abiertas o capilares son mucho más estrechas (0.52 a 0.25 mm
de diámetro interno) y pueden ser mucho más largas que las columnas empacadas ( de
30 a 100m). El diseño tubular abierto proporciona mayor resolución, menor tiempo de
análisis y mayor sensibilidad que las columnas empacadas, pero con el se maneja una
cantidad de muestra considerable menor.

Columna empacada diámetro interno 1/4 o 1/8 in

Empaque y fase
estacionaria
Acero inoxidable, vidrio,
cobre, teflón.

Columna capilar diámetro interno 1/16 in

Fase estacionaria
Silica Fundida
Capa de poliamida

Figura 5. Diferencia entre columna empacada y capilar.

El aumento en la resolución se debe a que la longitud de la columna es mayor por lo

cual aumenta el número de platos teóricos por unidad de longitud. El tiempo de análisis
se debe a que la columna contiene mucho menos fase estacionaria que en el caso de la
columna empacada, de modo que se retiene menos a los solutos.

El menor soluto de la fase estacionaria significa que la columna tubular abierta puede
aplicarse mucho menos muestra que a una columna empacada.

La sensibilidad es una medida de la relación señal-ruido del detector para una

concentración dada de analito en la solución inyectada. La sensibilidad que se obtiene
con una columna tubular abierta es mayor que la propia de una columna empacada,
debido a que (1) un gas óptimo para el funcionamiento del detector se agrega a la
corriente de la muestra al entrar al detector; (2) los contaminantes provenientes de la
septa se reduce por purga continua del sistema de entrada; (3) se reduce el paso de fase
estacionaria de la columna hacia el detector, porque hay menos fase estacionaria; (4) las
fluctuaciones en el flujo del gas portador, que inducen fluctuaciones en la respuesta del
detector son amortiguadas por la considerable longitud de la columna capilar.

SOPORTE SÓLIDO

8
 Cromatografía

Las columnas empacadas contienen un líquido no volátil depositado en

partículas finas de un soporte sólido “inerte”. El soporte debe ser de un material
resistente en partículas pequeñas en forma constante, con gran área superficial. La
mayoría de los soportes son de diatomita (tierra de diatomeas), consistente en los
esqueletos de sílice de las algas microscópicas denominadas diatomeas. El soporte no
debe interactuar con los solutos, pero ningún soporte es del todo inerte. La silanización
con hexametildisilazina o diclorometilsilano ((CH3)2SiCl2) es una forma ampliamente
utilizada de reducir la interacción de partículas de sílice con solutos polares. Para
solutos muy reactivos el teflón puede ser un soporte útil.

La uniformidad del tamaño de partículas reduce el término de trayectorias

múltiples en la ecuación de Van Deemter, con lo cual también reduce la altura del plato
e incrementa la resolución. El tamaño reducido de la partícula reduce el tiempo
requerido para el equilibrio de los solutos, lo que mejora la eficiencia de loa columna.
Sin embargo menor tamaño de partícula, más presión se requiere para forzar la fase
móvil a través de la columna.

El tamaño de partícula de los soportes cromatográficos se expresa como tamaño de

malla, el cual se refiere al tamaño de poro de tamices por los cuales las partículas de los
soportes cromatográficos pasan o son retenidas. Una partícula con tamaño de malla
100/200 pasará por un tamiz número 100 pero no por otro número 200. El número de
tamiz se refiere a la cantidad de dos poros por pulgada lineal de malla.

Hay 5 formas de Chromosorb A, G, P, W y T; los cuales son disponibles con o

sin tratamiento y en una variedad de rangos de malla. Chromosorb es una marca
registrada para soporte sólido por Jhons Manville, aunque existen otras marcas como las
porapack, bondapack, que son equivalentes con ciertas restricciones.

FASE ESTACIONARIA

Existen una variedad increíble de fases líquidas disponibles para la

cromatografía de reparto gas-líquido. La elección de una fase líquida para un problema
dado es esencialmente empírica. Sé presentan a continuación las diferentes clases de
solutos que son retenidas con frecuencia por cada fase líquida. Una variedad de fases
líquidas puede ser apropiada para resolver un problema dado de separación.

Tabla 2. Fases líquidas comunes para columnas cromatográficas

9
 Cromatografía

I.- Baja Polaridad II.- Polaridad III.- Polares IV.- Muy polares
intermedia
Hidrocarburos Éteres Alcoholes Polihidroxialcoholes
saturados
Hidrocarburos Cetonas Ácidos carboxílicos Aminoalcoholes
olefínicos
Hidrocarburos Aldehídos Fenoles Hidroxiácidos
aromáticos
Halogenuros de Ésteres Aminas primarias Ácidos polipróticos
alquilo
Mercaptanos Aminas terciarias Oximas Polifenoles
Sulfuros Compuestos nitro (sin Compuestos nitro (sin
átomos de hidrógeno átomos de hidrógeno
en ) en )
CS2 Nitrilos (sin átomos de Nitrilos (sin átomos de
H en ) H en )

Según la temperatura máxima de trabajo hay otro tipo de fases líquidas coomo la que se
ven en la tabla 3.

Tabla 3. fases líquidas comunes usadas en Cromatografía de Gases

(silicones)
CH 3 CH 3

Si O Si O

CH 3 CH 3 r

SE – 30 350° C máx.

APIEZON (Hidrocarburos mezclados) 275 – 300° C máx.

OV – 17 (Metilfenilsilicona) 300° C máx.

HO CH2 CH 2 O H
n

CARBOWAX 20M 250° C máx.

Tetrahidroxietilendiamina EDTA 150° C

La cantidad de fase líquida utilizada se expresa como porcentaje en peso del

soporte líquido. Las cargas más comunes están en el intervalo de 2 a 10%. Por encima
del 30%, la eficiencia de la columna disminuye debido a que se forman algunas de fase
líquida. Abajo del 1% la superficie del soporte puede ser no cubierta por completo.

10
 Cromatografía

En general un gran porcentaje de fase líquida conduce a una mayor capacidad

para el soluto, tiempos de retención mayores, y mayor separación entre picos. Un
porcentaje más bajo da por resultados análisis más rápidos y valores más pequeños de
HETP.

En las columnas tubulares abiertas se utilizan fases líquidas similares, con

modificaciones que minimizan la descarga de fase líquida de la columna. Estas fases se
encuentran adsorbidas dentro del tubo de la columna y representan una capa llamada
film ticknes (capa delgada) que puede ir de 0.1 a 0.32 micras de espesor, lo que le da
una particularidad de solubilidad y resolución a la columna capilar. Otra particularidad
que debe tomarse en cuenta cuando se elige una columna, es la polaridad de la fase
estacionaria, en este sentido hay que recordar lo que alguna vez estudiamos “lo polar
disuelve lo polar y lo no polar disuelve lo no polar”.

El incremento de polaridad de la fase estacionaria con respecto al grupo funcional

orgánico que contiene, se comporta de la siguiente manera:

Alcanos
Baja Alquenos
Hidrocarburos Aromáticos
- Haluros de alquilo

Compuestos nitro
Eteres
Media Cetonas
Esteres

Aldehidos
Polaridad Aminas
Amidas
Alta Alcoholes
Fenoles
+ Acidos Orgánicos
Glicoles

Figura 6. Incremento de la polaridad con respecto al grupo funcional.

En las columnas empacadas como en la tubulares abiertas se emplean varias

fases estacionarias sólidas. La alúmina (Al2O3) es un material común que puede separar
hidrocarburos en cromatografía de reparto gas-sólido. Los tamices moleculares son una
notable fase sólida ampliamente usada en cromatografía; son materiales inorgánicos o
polímeros orgánicos con grandes cavidades en las cuales pueden entrar moléculas
pequeñas que son parcialmente retenidas.

Es posible separar entre si moléculas pequeñas como H 2°, O2°, N2°, CO2, y CH4.
También pueden sacarse gases haciéndolos pasar por trampas que contienen tamices

11
 Cromatografía

moleculares, porque estos retienen fuertemente el agua. Los tamices inorgánicos pueden
regenerarse (secarse) calentándolos a 300° C a vacío o a un chorro de N2°.

Nota: Los términos como eficiencia, resolución y platos teóricos se trataran al final del
documento en el apartado de parámetros cromatográficos.

DETECTORES

El detector cromatográfico es un recurso con el cual se identifica y mide la cantidad

de componentes separados por el gas portador.

Una de las clasificaciones digamos clásica de los detectores se divide en:

 integrales
 diferenciales.

Detector integral.

Es aquel que da una respuesta proporcional a la masa total del componente en la zona
eluída. Cuando el gas portador pasa a través del detector, el registrador muestra una
línea recta (línea base), cuando un componente pasa a través de la zona, la pluma del
registrador se mueve a través de la carta por una distancia proporcional a la masa total
del componente en la zona.

El cromatograma que produce un detector integral consiste en una serie de etapas que
corresponden a cada componente (figura 7).

R
E
S
P
U
E
S
T
A

T 1 T2 Tiempo

Figura 7. muestra un cromatograma integral.

Detector diferencial.

Es aquel que da una respuesta proporcional a la concentración o a la masa de velocidad

de flujo del componente eluído. El ejemplo de un detector que responde a la

12
 Cromatografía

concentración es el de conductividad térmica, el detector de ionización de flama (FID)

es un ejemplo de un detector que responde a la masa de la velocidad de flujo.

El cromatograma que se obtiene con un detector diferencial consiste en una serie

de picos, cada uno de los cuales corresponde a un componente diferente (figura 8). El
área bajo el pico es proporcional a la masa del componente.

mV

Figura 8. Cromatograma de un detector diferencial

CARACTERISTICAS PARA UN DETECTOR

Los detectores cromatográficos difieren uno de otros en su principio de operación, por

lo que resulta difícil compararlos; sin embargo, presentan ciertas características que son
indicativas para la utilidad del detector, estas características son:

1. Selectividad.
La selectividad de un detector depende del principio de operación. Un detector de
conductividad térmica responde al cambio en la conductividad térmica entre la muestra
y el gas de arrastre, la conductividad térmica es proporcional al peso molecular, para el
componente.

2. Sensitividad o detectabilidad.
Para los detectores que responden a la concentración, la sensitividad es la respuesta del
detector en milivolts por unidad de concentración de la muestra.

3. Respuesta.
La respuesta de un detector es la Cantidad de una señal generada para una cantidad de
muestra dada.

4. Ruido y mínima cantidad detectable.

Es la señal eléctrica de salida de un detector, la cual se puede incrementar a un valor
deseado por medio de una amplificación electrónica. De esta forma, el ruido eléctrico y
la sensitividad del detector, se pueden agrandar como se desee. La mínima cantidad

13
 Cromatografía

detectable es la cantidad para una respuesta del detector igual a dos veces el nivel de
ruido.

5. Rango lineal.
La exactitud de un análisis cuantitativo, depende de la relación lineal entre la
concentración y la respuesta del detector; podemos definirla como la relación de
concentración grande o pequeña con la cual el detector es lineal.

Los más comunes detectores empleados en cromatografía de Gases.

 Conductividad térmica TCD

 Ionización de Flama FID
 Captura de electrones ECD
 Fotométrico de flama FPD
 Termoiónico específico TSD
 Det. de Hall de conductividad electrolítica HECD
 Espectrómetro de masas MS

Detector de Conductividad Térmica (TCD).

Este detector consiste en una serie de filamentos montados coaxialmente en uno o dos
cilindros metálicos; los filamentos se calientan por medio de una corriente eléctrica,
alcanzando una temperatura deseada. Para los detectores de un cilindro metálico, al
pasar el gas de arrastre por él, la temperatura del filamento dependerá de la naturaleza
del gas de arrastre y de su flujo; al introducir una substancia diferente al gas de
arrastre, la temperatura del alambre variará si la substancia introducida tiene un valor
de conductividad térmica diferente al del gas de arrastre.

Para los detectores compuestos de dos cilindros metálicos, se hace pasar gas de arrastre
por uno de ellos, en tanto que, por el otro, se hace pasar el gas de arrastre y la muestra,
por lo que se tendrán dos temperaturas diferentes para los dos filamentos; como un
cambio en la temperatura produce un cambio en la resistencia eléctrica del filamento,
tendremos dos resistencias diferentes; por consiguiente, el cambio de resistencia del
segundo filamento, en relación al primero, se puede registrar haciendo que los
filamentos formen parte de un puente Wheatstone. Como la variación de la resistencia
es debida a la presencia de la muestra, el registro será proporcional a la cantidad de
sustancia que pasa por el detector.

Los detectores de conductividad térmica se denominan a veces detectores universales,

ya que tienen respuesta para todas las substancias con excepción del gas de arrastre, los
análisis que se realizan son generalmente no destructivos, tienen menor sensibilidad que
los detectores de ionizaci6n. Su respuesta es dependiendo de la concentración de la
muestra en el gas de arrastre.
Los parámetros más importantes en la operación de un detector de conductividad
térmica son:

a) Corriente del filamento;

14
 Cromatografía

b) Temperatura del bloque del detector (distinta a la temperatura del filamento en sí);
c) muestra;
d) Gas de arrastre
La tabla 4 nos proporciona los valores de conductividad térmica para algunas
moléculas (en unidades c.g.s. y a 0°C), la conductividad térmica disminuye al
incrementar el peso molecular.

Tabla 4. Conductividad Térmica

Gas  x 105 a 0°C Peso molecular
Hidrógeno 41.6 2
Helio 34.8 4
Metano 7.2 16
Nitrógeno 5.8 28
Argón 5.1 40
Pentano 3.1 72
Hexano 3.0 86

Detector de Ionización de Flama (FID)

El detector de ionización de flama es el detector más importante en cromatografía, su

respuesta es para casi todos los compuestos orgánicos, tiene una sensitividad
relativamente alta y tiene un amplio rango de respuesta lineal. El FID permite análisis
rutinarios de compuestos en el rango de nanogramos (10-9g).

El mecanismo de la producción de ionizaci6n en el FID consiste en la combustión de la

muestra orgánica a una temperatura alta producto de una flama de H 2/aire. La flama del
FID es un ejemplo clásico de una difusión de flama; el efluente de la columna se mezcla
con el H2 y se propaga hacia el centro de un quemador, el aire se suministra alrededor
de la periferia del quemador. El H2 y el aire se mezclan por un proceso de difusión de
tal manera que, por medio de un encendido eléctrico se produce una flama cuya
temperatura es del orden de 2000°C.

La reacción química ocurre en la flama del FID en la conversión de H2 y 02 a vapor de

agua, cuando un compuesto orgánico se quema en la flama se generan iones positivos y
negativos; los iones positivos son colectados sobre un electrodo colector produciendo
una corriente eléctrica en proporción a la cantidad de materia quemada. Esta corriente
se amplifica por un electrómetro, el cual produce una señal de salida capaz de graficar.

Selectividad del FID: El detector responde a la mayoría de los compuestos con la

excepción de los que se enlistan en la figura 9.

He 02 SO2 CO SiHC13

Ar N2 NO C02 SiCl4

Kr CS2 N2O H20 SiF4

Ne COS NO2 HCHO

15
 Cromatografía

Xe H2S NH3 HCOOH

Figura 9. Compuestos que dan un mínimo o no dan respuesta al FID.

Respuesta del FID contra la velocidad de flujo

La respuesta del detector depende de la selección apropiada de las velocidades de flujo

para los gases que requiere para su operación (gas acarreador, hidrógeno y, aire). En
general, una buena sensitividad y estabilidad se pueden obtener con una velocidad de
flujo para: 30 ml/min de gas acarreador, 30 ml/min de H2° y 300 ml/min de aire.

La Figura 10 muestra la afinidad entre la sensitividad del detector y la velocidad de

Flujo para el H2, usando un flujo de 30 ml/min de gas portador ), un flujo de 300
ml/min de aire. La mayor respuesta del detector para propano se alcanza con un flujo
de 30 ml/min de H2°.

0.02
Sensitividad
0.015(Cal/g)

0.01

15 20 25 30 35 40 45
Flujo de H2 (ml/min)

Figura 10. Sensitividad del FID contra el flujos de H2.

Como se muestra también en la Figura 11 la velocidad de flujo del aire afecta la

sensitividad del detector, por lo general, una velocidad de flujo de 300 ml/min es
satisfactoria para obtener una buena respuesta.

Sensitividad

0 100 200 300 400 500

Flujo de aire (ml/min)

Figura 11. Sensitividad del FID contra el flujo de Aire.

16
 Cromatografía

Detector de Captura de electrones (ECD)

•Responde a compuestos que contienen grupos funcionales electronegativos

•Su aplicación más común es para halógenos. También responde al antraceno,

cetoesteroides, nitrobencenos y fenoles; fumaratos, oxalatos, cetonas conjugadas.

Grupo
electronegativo
Gas de Disminución de la
63
Ni arrastre Iones 
corriente de la celda

Corriente de fondo estable a través de los electrodos

de la celda

Figura 12. Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de

electrones

Detector Fotométrico de Flama. FPD

•Este detector contiene un detector de flama, que realiza su misma función y después
pasa a través de un filtro que lleva la muestra a su estado elemental, muy usado para la
detección de compuiestos que generan una emisión de luz o quimioluminiscencia.

•La ventaja de este detector es que pueden hacerse análisis rápidos de compuestos de
azufre y fósforo atómico.

•Se emplea básicamente en la industria petroquímica.

Termoiónico específico TSD

•Trabaja mediante una señal de quimiluminiscencia, es específico para compuestos que

contienen nitrógeno y fósforo.

•Es ~500 veces más sensible a especies orgánicas que contienen P que el FID.

•Es ~50 veces más sensible a especies orgánicas que contiene N que el FID.

17
 Cromatografía

•Suprime la respuesta a carbón por 3 ó 4 ordenes de magnitud.

•Una esfera de cerámica ( Sulfato de Rubidio) calentada 600-1000°C suministra E para

la oxidación, cuya superficie actúa como catalizador para formar iones selectivos de N y
P, mientras que provee condiciones pobres para la formación de iones de C.

Det. de Hall de conductividad electrolítica HECD

Este detector funciona al monitorear el flujo de conductividad, la conductividad cambia

cuando el efluente de un gas es incinerado en un horno y el resultado de la combustión
es burbujeado a través de un flujo continuo, este es bombeado a través de un
conductimetro que actúa como detector. Este detector se emplea en el análisis de
especies halogenadas, sulfuradas o nitrogenadas.

Espectrómetro de masas MS
La técnica que emplea este detector se considera como un método acoplado, pues se
emplea una técnica separativa, y una técnica espectrométrica, como medio de detección,
este equipo se emplea cuando se requiere la identificación inequívoca de los
componentes de la mezcla pues tiene la ventaja de reportar el espectro de masas de los
analitos separados además del tiempo de retención. Gracias a la versatilidad del método,
se emplea en el análisis de compuestos contaminantes del agua, del suelo y del aire, así
como para muestras biológicas, en busca de metabolitos de compuestos tóxicos.

18
 Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

Tradicionalmente la cromatografía de líquidos (HPLC), se realiza en las técnicas de fase

normal y fase reversa o fase inversa, aunque existen también técnicas como la
cromatografía de partición de intercambio iónico o de apareamiento iónico y
Cromatografía de afinidad. Se explican a continuación brevemente.

Cromatografía de adsorción en fase normal

En esta tipo de técnica, los compuestos son retenidos por la fase estacionaria sobre la
cuál éstos son adsorbidos. La fuerza de interacción de la molécula con la superficie
activa de la fase estacionaria determina el tiempo que tardará la molécula en atravesar la
columna. Las fases estacionarias y móviles más utilizadas en cromatografía de
adsorción en fase normal son las siguientes:

Fase estacionaria Fase móvil

SiO2 Hexano
SiO2-(CH2)n-NH2 Heptano
SiO2- (CH2)n-CH2O-CH3O Metanol

Cromatografía de adsorción en fase inversa

En la cromatografía de adsorción en fase inversa (RPC), la retención de los

componentes de una mezcla se lleva a cabo, por medio de fenómenos de adsorción de
éstos a la superficie de la fase estacionaria. La diferencia con la cromatografía de
adsorción en fase normal, radica en las polaridades invertidas de las fases estacionaria y
móviles (ver figura 13), es decir el sistema de fase reversa consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil polar. La fase estacionaria está conformada por
silicatos de estructura porosa sobre las cuales se encuentran unidas químicamente
cadenas hidrocarbonadas. Las fases más utilizadas son las cadenas de n-octil (RP8) y n-
octadecil (RP18). Las fases estacionarias y móviles más comunes son:

Fase estacionaria Fase móvil

SiO2- (CH2) 17-CH3 Metanol/Agua
SiO2- (CH2) 17 CH3 Acetonitrilo/Agua

En RPC el porcentaje de agua en la fase móvil tiene una enorme influencia, puesto que
un aumento del 10% de agua en la fase móvil puede duplicar el factor de retención.

De esta manera se puede modificar la retención de los componentes haciendo variar la

polaridad de la mezcla eluyente.

19
 Cromatografía

Figura 13. Diferencia entre cromatografía de fase normal y de fase inversa

Cromatografía de Partición

En la cromatografía de partición líquido – líquido, la fase estacionaria es un fluido, es

decir el soporte poroso de sílice se encuentra recubierto de una delgada película de
disolvente. En este sistema es requerido que la fase móvil sea inmiscible con la fase
estacionaria. La separación de la mezcla se debe a la diferencia de solubilidad de los
compuestos a analizar en la fase móvil o estacionaria. Aquí se aplica el coeficiente de
partición de NERNST. Si una sustancia se disuelve más fácilmente en la fase
estacionaria, tendrá una retención mayor que una sustancia soluble en la fase móvil e
insoluble en la fase estacionaria. La cromatografía de partición puede realizarse tanto en
fase normal como en fase inversa.

Cromatografía de intercambio iónico o de apareamiento iónico

Esta se utiliza para separar moléculas cargadas. La separación se debe a diferencias en

los equilibrios electrostáticos entre la fase estacionaria cuya carga es inversa a la de la
fase móvil.

La fase estacionaria consiste en una resina o un sólido generalmente poroso cuya

superficie está recubierta de grupos ionizados o ionizables. Los iones que aseguran la
electroneutralidad de la estructura son móviles e intercambiables con los de la fase
móvil en contacto con el intercambiador. Los intercambiadores más utilizados son
resinas poliméricas, las cuales normalmente son geles y sílices intercambiadores de
iones. La retención de un compuesto de carga opuesta dependerá de la fuerza de dicha
carga. El apareamiento iónico es una asociación entre el ión problema y un contra-ión.
(agente de apareamiento de carga opuesta añadido a la fase móvil). Ion y contra-ión
forman un complejo neutro hidrófobo, el cual es adsorbido sobre la resina. La retención
se efectúa por medio de un mecanismo de intercambio iónico y de adsorción.

20
 Cromatografía

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es una variante de la cromatografía de adsorción y se

realiza preferentemente para purificar, aislar, concentrar compuestos y para el análisis
de moléculas bioquímicamente activas.

El sistema de fases está compuesto de una fase estacionaria modificada químicamente y

de una fase móvil acuosa. Este fenómeno cromatográfico se apoya en el equilibrio de
intercambio entre los ligandos de la fase estacionaria y la biomolécula complementaria.

¿Cuáles son las partes de un cromatógrafo de Líquidos?

Figura 16. Esquema de un cromatógrafo de líquidos.

Figura 14 . esquema de un cromatógrafo de líquidos

1. Reservorio de disolventes (fase móvil)

2. Bomba
3. Inyector y Filtros
4. Luv (carga del inyector)
5. Columna (fase estacionaria)
6. Detector
7. Registrador

Un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento esta equipado con uno o mas

reservorios de vidrio o acero inoxidable, con capacidad para uno o más disolventes. Los
reservorios pueden o no estar equipados para extraer el gas disuelto en el disolvente que
contienen.

Cuando la separación emplea un solo disolvente se denomina elusión isocrática (figura

15a), cuando se requiere incrementar considerablemente la eficiencia de la separación se
emplean dos o más disolventes, en este caso se denomina elusión en gradiente (figura
15 b).

21
 Cromatografía

Figura 15. Ejemplo de la elución de una mezcla de 7 componentes a) lograda con un solo
disolvente de manera isocrática a una velocidad de flujo; b) lograda con una elución en
gradiente con una bomba binaria, empleando un flujo variable de dos disolventes.

Los equipos modernos están usualmente equipados con una cámara de premezclado a
velocidades que pueden variar en forma continua. Ver figura 16

Figura 16. Esquema de flujo de un cromatógrafo de líquidos.

22
 Cromatografía

A continuación se describen las partes más importantes de un sistema de cromatografía

de líquidos.

DISOLVENTES PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

(FASE MÓVIL)

Los disolventes empleados para la cromatografía de líquidos deben reunir ciertas

características, la calidad de pureza debe ser grado HPLC, ser transparentes al detector
usualmente al UV, la viscosidad debe ser mínima, limpios en el análisis al IR, y la
miscibilidad a la fase estacionaria es de considerarse si no queremos tapar la columna.

Además deben considerarse los siguientes parámetros ya que todos estos

influyen en la separación cromatográfica y en el caso de la toxicidad, es importante
considerar la cantidad de disolventes con que se trabaja y la cantidad de residuos que se
generaran.:

 Estabilidad (se debe asegurar que el sistema cromatográfico sea lo más estable
posible para hacerlo más repetible y reproducible)

 Polaridad (es uno de los factores que influyen en la separación cromatográfica)

 In-inflamabilidad. (por la seguridad en el trabajo)

 Efectos de mezcla (que la solubilidad de todos los analitos sea optima en el

disolvente y que la mezcla sea estable, no toxica)

 Compatibilidad con la columna empleada

BOMBAS

La mayoría de las bombas en los equipos de cromatografía líquida de alto

rendimiento, tienen salida de por lo menos 70 kg/cm 2 y preferiblemente de 280 a
420 kg/cm2. con una velocidad de flujo de por lo menos 3 ml/min. La velocidad de
flujo debe mantenerse constante dentro de +- 2%.
Existen dos tipos de bombas que se emplean comúnmente,
a) es una jeringa accionada por un tornillo. Produce una impulsión no pulsante que
se controla fácilmente, tiene el inconveniente de su baja capacidad y resulta
inadecuada para realizar cambios de disolventes.
b) es una bomba de movimiento alternado, estas bombas producen un flujo
pulsante que debe ser amortiguado, la ventaja de este tipo de bomba es que se
puede utilizar sin límite el volumen del disolvente, gracias a su reducido
volumen interno, son muy empleadas para la elución en gradiente.

23
 Cromatografía

Existe otro tipo de bombas llamadas neumáticas, se emplean en los modelos más
simples, la fase móvil se encuentra en un recipiente colapsable alojado en un vaso
al que se puede dar presión por medio de un gas comprimido. La capacidad y la
salida de presión son limitadas y la velocidad del flujo del líquido depende de la
viscosidad del mismo.

INYECTOR Y FILTROS

El sistema de inyección emplea a menudo válvulas giratorias para muestras como

las que se observan en la figura 17.

Figura 17. Válvula rotatoria para muestras

Izquierda: Posición de llenado Derecha: posición de inducción de la muestra a
la columna

Otro tipo de válvulas son las llamadas de corredera, están fabricadas de Kel-F y se
mueve en un plano entre dos piezas de politetrafluoroetileno.

La muestra se coloca dentro de una jeringa, con la cual se introduce por un orificio,
el cursor se mueve de izquierda a derecha y entonces la muestra queda colocada en
el flujo de la fase móvil.

24
 Cromatografía

Figura 18. Válvula de inyección de muestra. (Skoog an West , 1989)

LUV
(carga del inyector)

El sitio donde se carga la muestra es un rizo tubular de acero inoxidable conectado

al sitio donde se descarga la muestra al flujo de la fase móvil, estos sitios son
intercambiables y se fabrican de diferentes capacidades que van de 2 a 100 L.

Columnas para cromatografía de líquidos

La Columna
Es el espacio físico donde se produce la separación físicamente debe reunir ciertas
características básicas:
1) resistente: debe resistir altas presiones
2)Químicamente estable.

Usualmente las columnas están empacadas con una base de sílica o de un polímero
poroso con las características mencionadas en la tabla 5:

25
 Cromatografía

Tabla 5. Características de las columnas empacadas para HPLC.

Empaque Base sílica Base polimérica

pH de trabajo De 1 a 7 De 1 a 10
Característica + comunes, + delicadas,
s + económicas, mejor + caras,
resolución - resolución
mejor estabilidad a pH básicos.

Dado que los análisis en HPLC son más comunes en la industria farmacéutica,
química y alimentária, las columnas más usadas son las de tipo analítico. Con
dimensiones aproximada a 25cm de longitud por 4.6 cm de diámetro interno, son
columnas empacadas con partículas esféricas de 5 a 10 m, en años recientes el
diámetro interno ha disminuido, el empaque de las columnas se elabora más esférico y
pequeño, pero deben emplearse precolumnas de para asegurar la vida media de las
columnas y eficientar la repetibilidad y reproducibilidad delos resultados.

El empaque de las columnas es usualmente un tipo de silica gel, la cual contiene grupos
silanol (Si-O-H) estos grupos son muy polares por lo que son sustituidos por ligandos
C18 ó C8 tipicamente. Ver figura 19 y 20.

Figura 19. Sílica gel muestra el grupo silanol y una sustitución química
por un grupo no polar.

26
 Cromatografía

Alguna de las fases con las que son sustituidos estos silanoles son:

Amino, NH3 Octilo C8

R R

O Si (CH
2)3 NH
2 O Si (CH
2)7CH
3

R R

Butilo, C4 ODS C18

R
R
O Si (CH
2)17CH
3
O Si (CH
2)3CH
3
R
R

Ciano, CN, Nitrilo Fenilo

R R
O Si (CH
2)3
O Si (CH
2)3CN
R
R

Hexilo C6 SAX
CH
3
R R
O Si (CH
2)5CH
3 O Si (CH
2)3 N
+
CH
3CL-

R R
CH
3

Metilo, C1 SCX
CH3 R

O Si O Si - +
CH3 (CH
2)3 SO
3H

CH3 R

Figura 20. Fases para cromatografía de líquidos.

Elección de la columna.

Al analizar una muestra, después de resolver el problema de la extracción de los analitos

elegidos de la matriz compleja que representa la muestra como tal, el siguiente
problema es la elección de la columna, esto puede resolverse empleando la siguiente
tabla además hay métodos desarrollados por químicos analíticos especializados que
pueden consultarse en el área de aplicaciones de los catálogos de la EPA, ATSDR, o de
los proveedores de los equipos. Ver figura 21.

27
 Cromatografía

Peso Solubilidad Carácter Tipo de Fase estacionaria de la

molecular columna
uma cromatografía
No ionico Fase reversa injertada RP8, RP18, CN,
RP8E, RP18E
Intercambio de Poliespher CHPB
ligandos, CHCA, CHNA
carbohidratos

28
 Cromatografía

Fase reversa, control RP8, RP18, CN,

de iónes RP8E, RP18E
Fase reversa, Poliespher C18
polimérica
Fase reversa RP selectiva B, RP8,
Iónico apareamiento iónico RP18
Exclusión iónica Poliespher OAKC,
Ácidos orgánicos OAHY, AAAC
Cromatografía iónica, ICAN anions
mineral, ácidos, ICCA cationes
aminas
Soluble en THF Permeación en gel, Lichrogel PSI, PS4,
moléculas pequeñas PS20

Fase normal, Si 60, Si 100

Soluble en Hexano adsorción
Soluble en
Fase normal injertada CN, Dioles, NH2
disolventes
Soluble en metanol
orgánicos
y metanol/agua
Fase inversa injertada CN, NH2, C8, C18
RP8, RP18, 60
Fase inversa injertada selectiva B, 100,
300, RP8 y RP8E
Permeación en gel Lichrospher diol
Soluble en agua medio acuoso 100ª, 300ª, 1000ª,
PM>2000 4000A
Intercambio iónico Polyspher PEI
Polyspher CM2
Interacción hidrofoba Polyspher butyl
Soluble en disolventes orgánicos Permeación en gel Serie Lichrogel

Figura 21. Tabla de selección de fase y tipo de cromatografía.

Detectores más comunes para LC

En la cromatografía de líquidos de alta resolución no existe un detector universal como

tal, casi siempre es necesario seleccionar un detector con base en el problema que se
quiere resolver, eventualmente se requiere de dos o más detectores esto se debe a que la
fase móvil es un líquido de tal forma que los detectores estan limitados en sensibilidad y
selectividad. Los detectores más comunes en HPLC son los siguientes:

Detector Tipo Selectividad

Sensibilidad
Indice de refracción Universal Ninguna 10g/mL
UV/VIS Selectivo Dobles enlaces y aromáticos 1ng
Fluorescencia Selectivo Poliaromáticos 10pg/mL
Infrarrojo Selectivo Moléculas con   0 5 a 10ng/mL

29
 Cromatografía

Electroquímico Selectivo Especies oxidables

Masas (acoplado) Selectivo Iónes característicos ppb

Detectores Fotométricos

El detector más usado para HPLC es el ultravioleta, su costo de operación es

relativamente bajo, tiene alta sensibilidad e insensibilidad a cambios de temperatura,
velocidad de flujo y composición de la fase móvil. Entre los compuesto que absorben en
la región de ultravioleta , se incluyen todas las que tienen dobles enlaces y los
compuestos con electrones no enlazados y no compartidos como olefinas, y todos los
aromáticos, los que tienen un grupo carbonilo, tiocarbonilo, nitroso y azo. Para emplear
este detector el disolvente de la fase móvil debe no interferir con absorbancia en esta
región del espectro.

Detector de Fluorescencia

Básicamente este detector mide la luz emitida, mas que la absorbida, ciertas moléculas
reemiten la luz que absorben (luz UV) en forma de baja energía y altas longitudes de
onda, mismas que pueden ser utilizadas como una medida de la concentración del
analito en cuestión. Es muy usado para determinar pureza ya que muchos Hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HPA´s) son fluorescentes. La ventaja es que solo se genera una
señal cuando un compuesto fluorescente llega al detector. La significativa sensitividad
de este detector a fomentado el desarrollo de pre-columnas y pos-columnas que
realizan una derivación de compuesto que no son fluorescentes en compuestos que si
son fluorescentes para que el llegar a detector generen una señal y aumentar la
capacidad de la técnica.

Detector infrarrojo

Gracias a la presencia de diversos grupos funcionales en los compuestos analizados el

detector de infrarrojo es muy útil. Sin embargo solo pocos disolventes son transparentes
en la porción más útil de esta región del espectro, algunos de estos son tetracloro
metano (CCl4), triclorometano (CHCl3) , sulfuro de carbono (CS 2), mismos que son
infrecuentes en las separaciones cromatográficas.

Detector electroquímico

Los electrodos empleados en este tipo de detectores suelen contaminarse

frecuentemente, por lo que se desarrollaron sistemas de auto-limpieza automáticos. Este
tipo de detector es sensible a compuestos que pueden oxidarse o reducirse rápidamente
como fenoles, mercaptanos, aminas, compuestos nitro aromáticos, halogenados,
aldehidos, cetonas y especialmente benzidinas. La elección correcta del potencial
aplicado a los electrodos realza los límites de selectividad y sensibilidad del análisis.

30
 Cromatografía

Detector de masas ( acoplamiento de cromatografía de líquidos con espectrometría de

masas).

Con la espectrometría de masas, la química analítica tuvo un nuevo auge, ya que es una
de la herramientas más poderosas para la identificación de compuestos, los
espectrómetros de masas son relativamente fácil de acoplar a los cromatógrafos de
gases, el acople a un cromatografo de líquidos requiere de una interfase especializada.
Existen las interfases de rayo particulado muy usadas en análisis estructurales y la
interfase de termospray (para análisis cuantitativos). Con un rayo de partículas se
pueden generar espectros de masas de compuestos conocidos y desconocidos así como
por ionización química.

TERMINOS Y CONCEPTOS BASICOS DE LA CROMATOGRAFIA.

Figura 22. Grafica obtenida por la respuesta cromatográfica (cromatograma)

Descripción

Línea base. Es la línea dibujada por el registrador en ausencia de muestra.

Punto de inyección. Es el momento en el que se introduce la muestra al sistema

cromatográfico.

Tiempo muerto (tm). Tiempo que tarda un compuesto que no es retenido por la
columna, desde el punto de inyección hasta su paso por el detector.

Tiempo de retención (tr). Tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra,

hasta el punto máximo del pico correspondiente a determinado compuesto de la mezcla.

Tiempo de retención corregido (t’r). Equivale al tiempo de retención., menos el

tiempo muerto del compuesto que no es retenido por la columna.

31
 Cromatografía

Altura del pico (h). Es la distancia perpendicular, desde la línea base a la máxima
deflección del pico.

Amplitud de la base (wb). Es la distancia entre las intersecciones de las tangentes a los
puntos de inflexión con la línea base.

Amplitud a la mitad de la altura (w h). Distancia entre las tangentes del pico a la
mitad de su altura.

La resolución de los picos cromatográficos está relacionada con 2 factores: la

eficiencia de la columna y la eficiencia del solvente.

Adsorbente. Fase estacionaria para cromatografía gas – sólido.

Derivación. Reacción química que se hace con la muestra con reactivos específicos,
para dar termoestabilización y volatilidad, facilitando la separación y la detección de
algunos compuestos.

Eficiencia. Grado de ensanchamiento del pico, separación efectiva de picos adyacentes.

Se expresa como número de platos teóricos (n) requeridos para tener una separación
aceptable y también como altura equivalente de plato teórico (HETP).

Integración. Medición del área bajo la curva (pico) en un cromatograma.

Relación de Partición (k). - Es la relación existente entre la cantidad de muestra en la

fase móvil.

Retención relativa de dos picos adyacentes (). Proporcionalidad de las relaciones de

particulación de os componentes de una muestra. También conocida como selectividad.

Salinalización. En la sustitución de los hidrógenos activos en una molécula orgánica

con grupos trimetilsilil (TMS) para incrementar la volatilidad y su estabilidad térmica.
Se utiliza también para hacer inertes los sitios activos de algunos solventes

Ecuación de Van Deemter*. Se refiere a la eficiencia relacionada con el flujo de fase

móvil, expresándola como:
H = A + B /u + C·u
donde:
A. Expresa la contribución de la difusión de Eddy al ancho del pico, esto es
independiente del flujo del gas y es proporcional al diámetro promedio de la partícula y
a las irregularidades del empaque.

B. Expresa la contribución a la difusión molecular en el ancho del pico, la

magnitud del termino es inversamente proporcional al flujo y directamente proporcional
a las tortuosidades de los canales del sistema.

32
 Cromatografía

C. Expresa la contribución a la resistencia en la transferencia de masa, en el

ancho del pico y es directamente proporcional al flujo y al cuadrado del espesor de la
película de la fase líquida e inversamente proporcional a la difusión en la fase líquida.

PARÁMETROS CROMATOGRAFICOS

EFICIENCIA DE LA COLUMNA

La eficiencia de la columna se mide por el número de platos teóricos; al comparar la

eficiencia de las columnas, debemos ser específicos al solvente, soluto, temperatura,
velocidad de flujo y tamaño de la muestra.

Cuando una sustancia entra a la columna junto con el gas de arrastre, se disolverá en la
fase liquida hasta que se establezca un equilibrio, de acuerdo con los valores de la
concentración en la fase estacionaria y en la fase m6vil. Durante el paso de la sustancia,
a lo largo de la columna, este equilibrio se rompe por efecto de transporte y debe
restablecerse consecutivamente. Desde el punto de vista teórico, es conveniente
considerar este proceso en varios pasos discontinuos de equilibrio; es como si
dividiéramos la columna en un número de secciones iguales entre si; en cada una de
estas secciones, el equilibrio vapor-liquido debe restablecerse. Se ha denominado a
cada una de estas secciones "Plato Teórico"
El valor del número de platos teóricos puede obtenerse de un cromatograma, a partir de
la expresión siguiente:
N = 16 ( x/y)2
donde "x" es el tiempo de retención del componente y "y" es la amplitud de la base, por
lo que, se tiene:
N =16 ( tr/wb)2
El número efectivo de platos teóricos para una columna equivale a:

N ef =16 Ctlr/wb )2
donde: t’r = tr - tm
A partir del número de platos y conociendo la longitud de la columna, podemos
encontrar el valor de la altura equivalente de un plato teórico (HETP).

HETP =L/N

donde: "L" es la longitud de la columna cromatográfica, usualmente en cm.

EFICIENCIA DEL SOLVENTE

La eficiencia del solvente está relacionada con los siguientes cuatro aspectos.

1. Fuerzas de interacción y coeficiente de partición.

33
 Cromatografía

a) Orientación o fuerzas keesom: Fuerzas resultantes de la interacción entre dos dipolos

permanentes. El enlace de hidrógeno es un tipo importante de fuerza de orientación,
que particularmente se encuentra en cromatografía de gases.

b) Dipolo inducido o fuerzas Debye: Fuerzas resultantes de la interacción entre el dipolo

permanente de una molécula y el dipolo inducido de una molécula vecina. Estas fuerzas
son generalmente pequeñas.

c) Dispersión o Fuerzas no-polares (London): Fuerzas acumuladas de las variaciones

sincronizadas en los dipolos instantáneos de l interacción de los especies.

d) Fuerzas de interacción específica: resultado de fuerzas de los enlaces químicos,

formación de complejos entre el soluto y el solvente.

2. Eficiencia del solvente y temperatura.

La eficiencia del solvente se mide por la retención relativa () de 2 componentes

x2
x1
x1’
x2’

Inyección To T1 T2

Figura 23. Retención relativa para 2 compuestos.

Retención relativa:
= x’2/x’1 si =1, no hay separación

 es la relación de los tiempos de retención corregidos o coeficientes de partición para 2

picos. La retención relativa difiere del factor de separación (F.S), donde SF es relación
de los tiempos de retención sin corregir.

x 2 tr2
SF  
x1 tr1

3. Resolución (R).

34
 Cromatografía

La separación real de dos picos consecutivos se mide por la resolución, R es una medida
de las eficiencias de la columna y el solvente.

Figura 24. Medidas para obtener la resolución de dos picos

2d  tr2  tr1 
R o bien R  2 
w1  w2  w1  w2 

El valor de la resolución R dependerá de que tan bien definidos estén los picos. R=1
Significa que los picos están separados al 98% o sea que el 2% de los picos están
traslapados, R=1.5 significa que los picos están completamente separados (99.7%
separados).

4. Número de platos para una separación requerida

J.H. Punell desarrolló una ecuación para determinar el número de platos requeridos, así
como la longitud de la columna requerida, la expresión es la siguiente:

2 2
    k'2 L 
N req  16 R  2
  
  1  k'2 
donde
k’2 es el factor de capacidad para el segundo pico (pico más retenido), el factor de
capacidad k, también puede definirse como el tiempo que pasa un compuesto en la fase
liquida de la fase estacionaria.

tr ' 2 tr '
k '2  k'
tm to
donde:
K es el Factor de capacidad
L es la longitud
N reg
Lreq  Lorig 
N orig
CROMATOGRAFÍA DE GASES Y LÍQUIDOS
MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN

35
 Cromatografía

Análisis cualitativo
Se basa en la diferencia de velocidades de migración de los componentes de una
mezcla entre dos fases; una estacionaria y una móvil (gas), de tal manera que cada
componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria y eluye a un cierto
tiempo (tiempo de retención), dependiendo del programa empleado para su análisis.

Análisis cuantitativo
El auge creciente de la cromatografía durante las últimas cuatro décadas se debe
en parte a su rapidez, simplicidad, relativamente bajo costo, y a su gran aplicabilidad
como herramienta de separación. Su uso se ha extendido tanto porque puede también
proporcionar información cuantitativa acerca de las especies separadas. Por lo tanto
debemos tener en cuenta los aspectos cuantitativos aplicados a todos los tipos de
cromatografía.

La cromatografía en columna cuantitativa se basa en la comparación de la altura,

o del área, del pico del analito con la de uno o más estándares. En cromatografía plana,
el área cubierta por las especies separadas sirve como parámetro analítico. Si se
controlan las condiciones adecuadamente, esos parámetros varían linealmente con la
concentración.

Existen diversos métodos de cuantificación en cromatografía los cuales se

describen brevemente a continuación.

Método del % de Área

- Todos los componentes deben ser registrados.

- El factor respuesta para todos es el mismo.
- % de área.

Supongamos que el presente cromatograma se obtuvo de la inyección de un problema:

Ai
%A  n
 100
El porcentaje de área se obtiene mediante la fórmula
A
1
i

Donde:
A representa el área bajo la curva de cada uno de los componentes i

36
 Cromatografía

*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA

1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra

Método del % de Normalización.

- Todos los componentes deben ser registrados.

- El factor respuesta para cada componente de la muestra es diferente.
- Se emplea un estándar de cada uno de los componentes de la muestra para
determinar el factor de respuesta.

*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA

1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra

En este caso se conoce la identidad de todos los componentes mediante su tiempo de

retención al correr estándares con las mismas condiciones cromatográficas y la misma
concentración por lo que se puede obtener una tabla como la siguiente:

Datos de la muestra estándar

*PICO No. tr (min.) AREA CONC (mg)
1 2.71 50.000 15
 2 (ref) 3.48 70.000 15
3 4.23 80.000 15
4 5.78 65.000 15

Para homogenizar la respuesta de cada uno de los componentes de la mezcla se debe calcular
el factor de respuesta de cada uno de los analitos que aparecen en la muestra. Este factor será
multiplicado por el área que corresponde a su analito con lo que se puede obtener una
respuesta corregida matemáticamente similar en todos los casos.

¿Como se calcula el factor de respuesta? ref = estándar de referencia.

. i = Analito
Factor de Respuesta (FR) C = Concentración
FRi =  Ci  x  A ref  A = Area

37
 Cromatografía

Ai C ref

FR 1= __15 x 70.000 = 1.4 FR1= 1.4

50.000 15

FR 2= __15 x 70.000 = 1.0 FR2= 1.0

70.000 15

FR 3= __15 x 70.000 =0.875 FR3= 0.875

80.000 15

FR 4= __15 x 70.000 = 1.076 FR4= 1.076

65.000 15

Ya obtenido el factor de respuesta se aplica la siguiente formula para obtener el

porciento de normalización (% N).

%N = Ai x FR i x 100
ni=1 Ai x FR i

CALCULOS

% N 1 = _______________(85.000) (1.4)_____________
(85.000) (1.4) + (72.000) (1) + (43.200) (0.875) + (23.305) (1.076)

% N 1 = _________119.000_______ % N1 = 46.8732
119,000+72,000+37,800+ 25,076.18

% N2 = (72.000) (1) x 100

253,876.18 %N2 = 28.3602

% N 3= 14.8891
%N3 = (43,200) (0.875) x 100
253,876.18

%N4 = 9.8773
%N4 = (23,305) (1.076) X 100
253,876.18

%N T = 99.9998

Método del Estándar Externo.

Se debe inyectar primero la mezcla en el cromatógrafo con cantidades conocidas de

cada uno de sus componentes de interés y determinar el factor de respuesta de cada

38
 Cromatografía

componente. La relación de la cantidad de estándar con la respuesta (usualmente el área del

pico) es conocida como factor de calibración para ese componente particular.

Cuando se analiza una mezcla de concentración desconocida, la cantidad de cada

componente es obtenida multiplicando
- El factor de respuesta para todos es calculado.
- Se inyecta siempre la misma cantidad.

Hacer cromatograma problema y las áreas halladas dividirlas por el factor de respuesta.

Calibración y Patrones

El método más sencillo para el análisis cromatográfico cuantitativo implica la

preparación de una serie de disoluciones de patrón de composición a la de la muestra. A
continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o áreas
de pico en función de la concentración. La representación de los datos debería originar una
línea recta que pasara por el origen de coordenadas; los análisis se basan en esta gráfica. Para
una mayor exactitud es necesario una estandarización frecuente.

Datos de la muestra. i=1

*PICO No. tr (min.) AREA % DE AREA
1 2.71 85,000 37.6931
2 3.48 72,000 31.9283
3 4.23 43,200 19.1570
4 5.78 25,305 11.2215
TOTAL 225,505 100
*Datos de la muestra

Datos de la muestra estándar

*PICO No. tr (min.) AREA CONC (mg)
1 2.71 50.000 15
 2 (ref) 3.48 70.000 15
3 4.23 80.000 15
4 5.78 65.000 15

¿Como obtener el factor de calibración?.

Factor de Calibración (FC)

39
 Cromatografía

C ci
FC i 
Aci

FC1 = 15 mg = 3.000x 10 -4 FC1 = 3.000x 10 –4

50,000

FC2 = 15 mg = 2.142 x10 -4 FC2 = 2.142 x10 -4

70,000

FC3 = 15mg = 1.875 x 10-4 FC3 = 1.875 x 10-4

80,000

FC4 = 15 mg = 2.307 x 10-4 FC4 = 2.307 x 10-4

65,000

Al conocer Fci se puede aplicar la formula siguiente para obtener la cantidad del componente
(cx)

Cxi = ( A Ci ) ( F Ci )

CALCULOS

C1= (85,000) (3.000x 10 -4) = 25.5 mg C1= 25.5 mg

C2 = (72,000) (2.142 x10 -4) = 15.4 mg C2= 15.4 mg

C3 = (43,200) (1.875 x 10-4) = 8.1 mg C3= 8.1 mg

C4 = ( 25,305) (2.307 x 10-4)= 5.8 mg C4= 5.8 mg

Al utilizar este método, la fuente más importante de error en los análisis es normalmente
la incertidumbre en el volumen de la muestra; ocasionalmente la velocidad de inyección de la
muestra es también un factor a considerar.

A menudo, las muestras son pequeñas (aproximadamente 1 microlitro) y la

incertidumbre asociada con la inyección de un volumen reproducible de ese tamaño con una
microjeringa puede significar un cierto porcentaje relativo, tal vez de varias unidades.

EXACTITUD DEL VOLUMEN INYECTADO (FV)

40
 Cromatografía

Vim
FV 
V IS

Vim = Volumen inyectado de muestra

Vis = Volumen inyectado de estándar.

Entonces:
Cxi  ( AC IFV)( FC
I
V)

El método del estándar interno.

En cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue por el uso de patrones

internos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyección de
la muestra. En este procedimiento, el estándar interno elegido debe reunir las siguientes
características:

- Proporcionar un pico bien resuelto

- Aparecer en el cromatograma en la mitad del mismo.
- No debe encontrarse en la muestra
- Su composición debe ser similar a la de los componentes de la mezcla
- En caso de haber muchos picos en el cromatograma se pueden emplear más de 2
estandares internos.

1-. Se realiza un cromatograma patrón con todas las sustancias y el estándar interno con
cantidades conocidas. Se calcula el factor de respuesta de cada uno de los analitos con
respecto al estandar interno.

2-. Realizar el cromatograma problema con una cantidad de estándar interno conocida.
 (hacer 3 inyecciones y promediar)

3.- En caso de que el sistema no sea conocido se elabora una curva de calibración
incluyendo al estándar interno, con el fin de evaluar la linearidad del sistema.

4.- Conociendo:
área del analito (Ai),
l área del estándar interno (Aref), y
el factor de repuesta de ambos (FRref =1), así como la concentración del estándar interno
realizar el siguiente cálculo para conocer la concentración de i.

C ref  Ai  Fri 
Ci 
Aref

Referencias

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 Cromatografía

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3. Eurachem group. The Fitness for Prurpose of Analytical Methods. A Laboratory
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5. Jenennings Walter, Mehran Mehrzad F. Sample Injection in Gas
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10. Waters. Seminario de Selección de columnas. 2002.
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