INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E

INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

Laboratorio De Química de los Hidrocarburos

Reporte de práctica #2-3

Cromatografía en placa fina y columna

Nombre del alumno: Toral García Jorge

Mario

Grupo: 2IM09
 OBJETIVOS ALCANCES METAS

 Definir el  Documentarse en  Preparar las

concepto de conceptos de placas finas o
cromatografía y mezcla, pureza, cromatoplacas
aplicarlo en la propiedades , y los
purificación de físicas y químicas aplicadores
compuestos . de la materia.
 Preparar la
 Indicar en que  Leer con cámara
consiste la detenimiento el cromatografic
cromatografía desarrollo de la a
de adsorción y practica
la de partición
 Preparar las
 Analizar muestras
 Explicar el cuidadosamente
concepto de cada una de las  Aplicación de
polaridad en etapas de la las muestras y
cromatografía técnica de desarrollo de
cromatografía la placa
 Establecer la
relación y la  Consultar la tabla
 Revelado de
diferencia que de toxicidad de
existe entre la los reactivos y las placas
cromatografía productos
 Determinación
en placa fina y empleados en el
del Rf
la preparativa experimento

 Interpretación
 Seleccionar el  Tomar
de los
disolvente o precauciones
resultados.
mezcla de ellos adecuadas y
para efectuar el evitar accidentes.
desarrollo de la
cromatografía

 Purificar
compuestos
orgánicos
 mediante placas
preparativas

 Determinar el Rf
de
las sustancias
separadas

Investigación bibliográfica sobre el tema.

Cromatografía:

La cromatografía es uno de los principales métodos para la separación de

especies químicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La
cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y
otra móvil.

En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve en una fase

móvil, que puede ser un gas un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se
hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen fija
en una columna o sobre una superficie sólida. Las fases se eligen de tal forma que
los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil
y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con más fuerza
por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los
componentes que unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez.
Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se
separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o
cuantitativamente.

Cromatografía en capa fina

En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa

delgada de un adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa)
depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, o una lámina de
aluminio o de plástico.

La CCF es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de
componentes.
El proceso es similar a la cromatografía de papel con la ventaja de que se
desarrolla más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir
entre diferentes adsorbentes. La CCF es una técnica estándar en el laboratorio de
química orgánica. Debido a su simplicidad y velocidad, la CCF se utiliza a menudo
para monitorizar las reacciones químicas y también para el análisis cualitativo de
los productos de una reacción, puesto que permite conocer de manera rápida y
sencilla cuántos componentes hay en una mezcla

Procedimiento

Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una
capa delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una
pequeña cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la parte
inferior de la placa.

Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que sólo la

parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o eluyente es
la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad.

A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla
problema se establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los
componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que se encuentran en
disolución.

En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su

adsorción, de forma que unos componentes se desplazarán más que otros.
Cuando el eluyente llega a la parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta,
se seca, y los componentes separados de la mezcla se visualizan.

Visualización de las manchas

Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista.
Si no es así, hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a
cada componente de la mezcla.

Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona

un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en
todas partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto
orgánico.

Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecífico.

Emplear reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Esto se
puede hacer sumergiendo la placa de CCF en una disolución que los contenga o
en forma de spray.
Cálculo del factor de retención Rf

Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor
de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la
placa. Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente
empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido
del disolvente. De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una
mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente
cuando se hacen eluir en la misma placa de CCF).

Cromatografía en columna
Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos
deseados de una mezcla.

Procedimiento

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena

con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de
sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3))+. La muestra que se quiere separar se deposita
en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el
eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad,
hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el
soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la
columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a
diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a
otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento
a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de
elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la
muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los
diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes
polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla
por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará
las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si
el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca
separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es
muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del
eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se
utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para
determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.

En 1978 se introdujo una versión modificada denominada cromatografía en

columna rápida. La diferencia con la cromatografía en columna tradicional es que
en la técnica rápida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando
una presión positiva. Esto hace que las separaciones mejoren en resolución y se
pueda disminuir el tiempo de elución, por lo cual constituye un método de elección.

Análisis de los eluatos de la columna

Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el

progreso de la separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a
menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros. En este
caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos
rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografía en capa
fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo
producto, se reúnen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los
componentes por métodos espectroscópicos.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

CROMATOGRAFIA EN PLACA

MATERIAL A UTILIZAR:

 Aplicadores
 Porta objetos (placa) - cromatoplaca
 Disolventes (A,B,C)
 Placas
 Cámara cromatografica- frascos de gerber
 Vasos de precipitado (3)

CROMATOGRAFIA EN
 1.-preparacion de los aplicadores.

2. se aplican las muestras con los microaplicadores y

se dejan secar

3. PREPARACION DE LAS CAMARAS CROMATOGRAFICAS:

a) se coloca el disolvente en la cámara en la cantidad suficiente y

necesaria para que el nivel del disolvente quede por debajo de las
aplicaciones de las muestras.

4. se sumergen las placas en el disolvente de la

cámara

5. se miden los orígenes del disolvente para poder

hacer la medición y calcular el Rf
6. se deja correr el disolvente hasta cierta altura, teniendo
cuidado de que el disolvente de la cámara no toque el
origen de las muestras, y que la cámara este totalmente
cerrada.

7. sacar las placas y dejarlas secar, este paso es el revelado de placa

8. las muestras problemas de 3 componentes (3 colorantes)

se separaron con 3 disolventes problema.

9. en base a la separación de los componentes, se observo la

secuencia de colores, y la determinación de la polaridad de
los disolventes, y asi decidir cual es el mejor para utilizar en
la cromatografía en columna.
Costo beneficio (con respecto a otros medios de realización de la práctica)

Técnicas cromatográficas

1. Cromatografía en capa fina.

Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La
muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie
de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es
adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas
de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los
adsorbentes más utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea,
celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o
placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de
fluorescencia : f254 ó f366.

La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual

debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente
ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los
componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a
los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir
que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares
son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación.
Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de
métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados
coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico
para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos
físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.

El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el

primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y
propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y
comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas
patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden
realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de
emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría
por fluorescencia.
2. Cromatografía en papel.
El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel
cromatográfico en el tanque cromatográfico.

3. Cromatografía en Columna.
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido
de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el
cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada
en plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que
lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final
de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se
suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.
La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se
encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales
que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las
sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda
total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la
columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el
tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la
resolución.

4. Cromatografía de gases.
Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un
Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido
(Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de
ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido
inerte (Cromatografía Gas-Líquido).
El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y
una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna
normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada
(horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e
imprimir el cromatógrama. La muestra se introduce a través del sistema de
inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separación.
La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón contiene la fase
estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que
es generalmente de sílice.
La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a
través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar
interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de
minimizar la difusión gaseosa.
Al final de la columna existe el detector que permite la detección y
cuantificación de las sustancias, midiendo conductividad térmica y
electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo
eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un
integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los
componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama
en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del
 pico.

5. Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).

Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión
(entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la
longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado.
Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la
sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el
ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la
resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una
bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de
sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la
mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase
móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra.
A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción
ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que
eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan
mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar
la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su
contenido.
Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares,
que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La
cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la
curva del pico correspondiente.

6. Cromatografía de intercambio iónico.

La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene
grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas
(Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución
amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico
se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de
las proteínas a un valor de pH determinado.
La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta
influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución
(concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la
matriz.
La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse
gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil,
de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

7. Cromatografía por Permeabilidad en Gel.

Es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión
molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su
tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero
entrecruzado con poros de tamaños determinados.
 Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la
columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes
para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen
una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las
proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de
la columna es más lenta.

8. Cromatografía de Afinidad.
La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas
por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este
caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen
específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente
a la matriz de la columna.

Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o

eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado
retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una
solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la
interacción entre el ligando y la proteína.

Respecto a estos métodos analizados, se siguiere que por costos y complejidad,

que se realice la cromatografía en placa fina, papel o columna, ya que estos tres
métodos son los más apropiados para la práctica del laboratorio de química de los
hidrocarburos.
Usos y Aplicaciones de la Práctica

El campo de la cromatografía es muy amplio, donde haya productos orgánicos, allí

tiene aplicación la cromatografía, pero como los cromatógrafos, no son baratos,
casi siempre se limitan a empresas muy grandes, transnacionales, o que tengan
una cantidad de producción enorme por día.
Algunos ejemplos de aplicación:
1. Determinación del porcentaje de formación de la molécula de síntesis, en una
planta de síntesis orgánica.
2. Determinación de porcentaje de solvente en un producto agroquímico
terminado.
3. determinación de concentración de producto activo, en un producto agroquímico
terminado.
4. control de calidad de pureza de solventes, como alcohol etílico anhidro, tolueno,
xileno, benceno, que entran como materias primas a una planta.
5. determinación del contenido de principio activo de un antitusivo en una planta
de medicamentos.
6. determinación de concentración de alcohol bencílico, en un producto inyectado
en una fábrica de medicamentos.
7. control de calidad de la pureza de materias primas entrantes a bodega de una
fábrica de productos medicinales, tales como: alcohol etílico al 95%, propilenglicol,
glicerina, alcohol isopropilico, o-toluidina, paracetamol, butanol, octanol,
benzaldehido, acetato de etilo, éter di etílico, alcanfor, y muchos otros.
8. Control de calidad de producto terminado en una fábrica de cosméticos, como
por ejemplo, porcentaje de alcohol en una laca para el cabello, acetona en un
esmalte de uñas, colorantes en casi todos los productos elaborados, porcentaje de
control, en las esencias que se utilizan para la confección de PERFUMES, allí es
muy importante, realizar esta prueba.
9. En fábricas de adhesivos, pegamentos, pinturas, para controlar que el producto
terminado lleve las cantidades indicadas de solventes, humectantes, colorantes,
gomas, resinas, poliuretanos, secantes, rellenantes, esponjantes, suspensores,
emulsificantes.
10. en fábricas de alimentos, para control de calidad de producto terminado y
materias primas, tales como: proteínas, sabores, sustancias que dan el olor, o sea
aromatizantes, pues algunos son sintéticos, como el olor a pollo, y solo este tiene
variantes, como pollo con barbacoa, pollo frito, pollo asado, determinación de
colorantes.
11. En la industria petrolera, es un método indispensable, para analizar las
composiciones de casi todos los productos que van saliendo, del cracking, los
tipos de gasolinas, los compuestos orgánicos destinados a síntesis.
12. En el CONTROL de la producción vinícola, tiene infinidad de usos, desde
usarse como una nariz electrónica, para caracterización de vinos, de acuerdo a
parámetros previamente establecidos por expertos, concentración de
componentes, análisis de aminas, como etanolamina, etilamina, agmatina,
triptamina. Determinación de ocratoxina-A.
Interpretación de los espectros:

La placa utilizada con la

solución A, se puede
observar que hay una
separación parcial de los
colorantes utilizados, los
espectros revelados nos indican que la solución
A es una medianamente polar.
La placa utilizada con la solución B, no se
pueden observar cambios con respecto a la
placa antes de absorber la solución, la falta de
espectros nos indica que ésta solución no es
polar.
La placa utilizada con la solución C, se puede
observar que el colorante se corrió
completamente en la placa, sin dejar marcas parciales de este, es decir, el
espectro revelado está impreso a lo largo de la placa sin existir variaciones, lo cual
nos indica que ésta solución es completamente polar.
Después de realizado el análisis de cada solución, se utilizó la solución C
(solución polar) para observar la separación del colorante en un gis blanco, el cual
desplazó una mancha amarrilla hasta llegar a la punta de éste.

Conclusiones de la práctica:
  Se definió el concepto de cromatografía y se aplicó en la purificación de
compuestos, así como se indicó en qué consiste la cromatografía de
adsorción.
 Se estableció la relación y la diferencia que existe entre la cromatografía en
placa fina y la preparativa, también se concretó el conocimiento de la
polaridad en una sustancia y su influencia en la cromatografía, el cual nos
dice que la fuerza con que es absorbido un componente depende de la
polaridad de éste, de la actividad del absorbente y de la polaridad de la fase
móvil. En general, cuando más polar sea un compuesto, es más fácilmente
absorbida.
 Se definió y se entendió el concepto y la determinación del Rf de las
sustancias separadas
 Se desarrolló la cromatografía en placa y en columna para poder separar
los colores que contenía un colorante.
Conclusión general:
Después de la realización de esta práctica de la interpretación de los resultados
obtenidos, se concluye que por medio de la cromatografía es posible identificar los
componentes de una mezcla, además de que se trabajó con soluciones polar, no
polar y medianamente polar, las cuales nos indican que las soluciones polares son
mejores en el empleo de esta práctica para poder observar los espectros y así
calcular el Rf.
Observaciones:
Al realizar la práctica al utilizar las soluciones pudimos notar que la solución C era
la solución polar, ya que esta pudo desplazar el colorante de manera uniforme en
la placa cromatográfica, la solución B no desplazó nada el colorante, y la Solución
A lo desplazó dejando pequeñas marcas en la placa
El gis al utilizar la solución C desprendió un pequeño color amarillento que se
desplazó hasta el final
Al realizar la cromatografía en columna y al poner el colorante junto con la
solución C, el colorante se separó en 3, dos eran tono de azul muy parecidos y
había uno color morado.

Bibliografía:
http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html#simple
http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/cromatografa
http://es.wikipedia.org/wiki/Polaridad_(qu%C3%ADmica)
Hernández Luna Heliodoro. (2007). 4° edición, Química orgánica experimental a
escala semi micro y fundamentos de la espectroscopia. IPN, México, Pp. 119-133.