INTRODUCCIÓN A LAS

SEPARACIONES
CROMATOGRÁFICAS.
FUNDAMENTOS
CROMATOGRAFÍA
 Inventada Mikhail Tswett (1900) para
separar distintos pigmentos de la clorofila
pasándola por una columna de carbonato de
calcio.

C ol or
o ma=
C r α it o
χρομ E sc r
i n=
G r a ph e
α φ ω
γρ
Es la separación
de dos o más
compuestos
químicos en un
medio
Fase Móvil: Gas ó Líquido
Fase Estacionaria: Inmiscible; es
sólido o líquido fijado en un sólido.
La movilidad de los componentes de la mezcla a
separar depende de la afinidad química o
propiedades / FE & FM

Si 1 Componente tiene propiedades químicas = FM,

tendrá gran movilidad, es decir, el efecto de
retención que provocaría la fase estacionaria sería
nulo.

El Desplazamiento diferencial de los solutos

(Fenómeno de adsorción) al ser arrastrados por una
FM sobre una FE, nos permite identificar cuantos
componentes tiene una mezcla.
 CLASIFICACIÓN

 Cromatografía plana.
FE=Placa plana o papel
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina
 Cromatografía en columna.
FE=Columna
 Según el fluido empleado:
 Cromatografía de Líquidos
 Cromatografía de Líquida de Intercambio Iónico
 Cromatografía de Líquida de alta eficiencia
 Cromatografía de Líquida de Exclusión
 Cromatografía de Líquida de Adsorción
 Cromatografía de Líquida en fase Inversa y Normal
 Cromatografía de Gases
 Cromatografía de líquidos súper críticos
 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
FE= papel de celulosa.
FM= disolvente y la mezcla de
varios líquidos que contiene
agua.
Se aplica la muestra sobre el papel
Introducción del papel en la cubeta que
contiene el disolvente.
Éste atraviesa el papel por capilaridad
arrastrando los componentes de la
mezcla.
Separación en función de la afinidad por las dos
fases, las más solubles en agua se quedarán cerca
del punto donde se aplicó la muestra, y las menos
solubles en agua y más solubles en el disolvente
llegarán más lejos.
Las sustancias separadas se identifican mediante
diversos procedimientos físicos o químicos.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA
FE= Soporte inerte (Sílica)
FM= Eluyente y muestra

• Con la ayuda de un capilar de vidrio, una pequeña cantidad de

muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del extremo
inferior de la placa.

1
Los compuestos que avanzan a lo largo
de la placa se ven atraídos por fuerzas
sobre la superficie del adsorbente,
interaccionando el disolvente con
ambos.

Esta interacción competitiva establece

las velocidades relativas con que
ascienden por la capa de adsorbente,
el frente de disolvente y un
determinado compuesto. Cuanto mayor
es la polaridad de los compuestos, más
intensamente se ven éstos atraídos por
  Eluyentes mas  Adsorbentes más
comúnes: comunes:

 éter de petróleo  Silicagel (se utiliza en

 Tolueno
el 80% de las
 dietil-éter, t-butil-éter
separaciones)
 Diclorometano
 b) Óxido de Aluminio ó
 acetato de etilo
 n-pentano, n-hexano
Alúmina (ácida, neutra
ó básica)
 Ciclohexano
 c) Celulosa (Nativa o
 tetracloruro de carbono
 éter dietílico micro-cristalina)
 Cloroformo  d) Poliamidas
 Acetona
 Iso-propanol
 Etanol
FACTORES QUE INFLUYEN EN
UNA SEPARACIÓN POR CCF

Temperat
Limpieza ura
de las
Placas
Pureza de
los
disolvente
s
CROMATOGRAFIA DE
INTERCAMBIO IONICO
 La separación por cromatografía de intercambio
iónico depende de la adsorción reversible de una
molécula de soluto cargada a un grupo de
intercambiadores iónicos inmovilizados de carga
opuesta.

FE = resina de intercambio iónico que contiene grupos

cargados.
FM = generalmente una solución amortiguadora de pH
 5 ETAPAS

R
E
A
C
e
q
d
o
g
su
m
e
F
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in
z
SELECCIÓN DE LA MATRIZ

 Fuertes: permanecen ionizadas en todo el rango

útil de pH.
 Débiles: disminuyen su ionización en función del
pH.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA EFICIENCIA (HPLC)
-Gran sensibilidad
-Determinaciones cuantitativas exactas
-Determinación de compuestos no volátiles
(alto Peso Molecular, iones metálicos) o
termolábiles.

-El sistema HPLC requiere una mezcladora

de solventes, un inyector, y una bomba que
inyecte el líquido a la columna.
- La fase móvil fluye a través de la columna
estrechamente empaquetada.
-Presiones de hasta 1500 – 2000 PSI.
-Tiempo de análisis reducido.

-Los eluidos se identifican al abandonar la

columna por métodos:
UV Índice de Refracción Fluoresencia
VENTAJAS DE HPLC
Resolución Velocidad Sensibilidad
Elevada elevada

DESVENTAJA DE HPLC
Pequeña Limita
capacidad purificaciones a
gran escala
 APLICACIONES

 Pureza de materias primas

 Industria farmacéutica
 Productos de degradación
 Metabolitos en medicamentos en muestras biológicas
 Análisis toxicológicos
 Análisis de muestras medioambientales
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
EXCLUSIÓN (FILTRACIÓN EN GEL)
-Fase Estacionaria:
El material que llena la columna (gel
o resina) está formado por partículas
con poros de un cierto intervalo de
tamaños.

-Las moléculas mayores que los poros no

pueden entrar en ellos, por lo que "pasan
de largo" y avanzan por la columna
(eluyen) con mayor rapidez que las de
tamaño menor, que pueden entrar en los
poros y así realizan un recorrido mayor,
progresando más lentamente a lo largo de
la columna.
APLICACIONES
 DETERMINACIÓN DE MASAS MOLECULARES

 DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURA 3ª Y 4ª DE
PROTEÍNAS PURIFICADAS
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ADSORCIÓN
 Las moléculas se fijan sobre sustancias insolubles:

 Alúmina (Al2O3)
 Carbón activado
 Tierra de Diatomeas (Kieselguhr)
 Sacarosa pulverizada
 Gel de sílice

 Asociaciones de Van der Waals

 Enlaces H O
 Eluyente:

Cloroformo Hexano Éter Etílico

 Separa substancias No Polares

 Columna polar – Disolvente no polar

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS EN
FASE INVERSA Y FASE NORMAL

 Fase inversa (FI)

– Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar

 Fase normal (FN)

– Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar
FASE INVERSA
 Es la más utilizada actualmente.
 La separación se basa en interacciones hidrofóbicas
entre grupos hidrocarburo de la fase estacionaria y
del analito.
 Componentes más polares eluyen primero.
 La retención aumenta cuando aumenta la
hidrofobicidad del analito.
 FASE ESTACIONARIA APOLAR

 Sílica con hidrocarburos saturados,

insaturados o aromáticos de
diferentes tipos.

Más empleados:
• octadecil (C18)
• octil (C8).

Cuanto mayor es el #C, mayor es la

eficacia.
 FASE MÓVIL POLAR
 Agua o solución buffer con:
Metanol
Acetonitrilo
Tetrahidofurano
Acetato de etilo
Acetona

Cuanto menos polar es el disolvente, más fuerza eluyente tiene

VENTAJAS
 Elimina las colas de los picos.
 Menos sensible a impurezas en el eluyente.
 Se ha adaptado uso de columnas.
 HPLC: alta presión para mejorar la resolución y
reducir los tiempos de separación.
APLICACIONES
 Separación compuestos
 Farmacéuticos
 Bioquímicos
 Forenses
 Clínicos
 Industriales

 Purificacion de biomoleculas
 proteínas y péptidos.
 oligonucleótidos
 Desalado
 Analisis cuantitativo
FASE NORMAL
 Primera descrita, menos utilizada
 Basada en interacción de los analitos con grupos
funcionales polares de la superficie de la fase
estacionarial originada por fuerzas eléctricas entre
dipolos permanentes o inducidos.
 El componente menos polar se eluye primero,
debido a que es el más soluble en la fase móvil

Un aumento de la polaridad de la fase

móvil, hace disminuir el tiempo de
elución.
 FASE ESTACIONARIA Fase móvil
POLAR apolar

Solventes muy apolares:

• hexano
Sílica con grupo:
 grupo ciano • heptano

 diol mezclados con solventes

 amino más polares:
• isopropanol
 dietilamino
• cloroformo
• etilacetato

La fuerza de elución de la fase

móvil de modifica con n-hexano.
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
 Herramienta de separación muy potente debido a la
amplia gama de eluyentes disponibles que se pueden
utilizar para ajustar con precisión la selectividad de
una separación.
 Se ha dejado de utilizar debido a su complejidad.
 Período de equilibrado prolongado
 Problemas de reproducibilidad
 Sensibilidad de la técnica a presencia de pequeñas
concentraciones de contaminantes polares en la fase
móvil.
 Si esto se controla, se obtiene cromatogramas
mejores a los de fase reversa debido a la baja
viscosidad de los eluyentes que se utilizan
habitualmente.
APLICACIONES
 Separación de:
 PAHs (Hidrocarbonos Policíclicos Aromáticos).

Analizar trazas de sustancias potencialmente

cancerígenas y mutagénicas en aire, agua y
efluyentes.
 Lípidos
 Alcanos
 Esteroides
 Azúcares
CROMATOGRAFÍA DE GASES
 Es la técnica para la separación de
compuestos orgánicos e inorgánicos
térmicamente estables y volátiles
 Se produce como consecuencia de la
interacción de los componentes de una
mezcla vapor en una fase móvil gaseosa
inerte, con una fase estacionaria
(sólido/líquido) de alto punto de ebullición
sobre un sólido inerte
CROMATÓGRAFO DE GASES
PRINCIPIO
Gas portador: Medio de transporte de los componentes de la mezcla a
través del sistema cromatográfico.
Debe ser inerte: Ar, He, N2
 Columnas
Capilares:
Sílice fundida.
Diámetros interiores: 200-250 mm.
Longitud < 20 m.
Micro-empacadas
Tubulares abiertas
Empaquetadas

Tubo de acero inoxidable, niquel

o vidrio.
Diámetros interiores 1,6 -9 mm.
Longitud > 3 m.
Se rellenan de un material adsorbente adecuado.
 A MENOR DIÁMETRO, MAYOR EFICIENCIA Y RESOLUCIÓN

EL INCREMENTO DE LA LONGITUD DE LA COLUMNA INCREMENTA EL

NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS, Y ASÍ LA RESOLUCIÓN
Fases estacionarias
Separaciones por punto de ebullición de compuestos en
un intervalo amplio de pesos moleculares:
Escualano
Polidimetilsiloxano
Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos
polidifenildimetilsiloxano
policarboranometilcianoetilsilicón
Para compuestos nitrogenados
poliamida
policianoetilmetilsilicon
Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos
polietilenglicol
pentaeritritol tetracianoetilado
DETECTORES
Conductividad
térmica Detector de captura
de electrones (ECD)

Espectroscopía de
masas
Cromatografía líquidos supercríticos
PROPIEDADES DE LOS FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
La Tc de una sust. es la temp.
por encima de la cual no
puede existir en fase liquida
independientemente de la
presión.
La Pc es presión de vapor de
una sust. a su Tc.
Una sustancia a T y P por
encima de su Tc y Pc (punto
critico) =
FLUIDOS SUPERCRITICOS
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
Es una modalidad híbrida entre cromatografía de
gases y de líquidos que combina mejores
características de cada una de ellas y permite la
separación y determinación de compuestos que no
son manipulados esas cromatografías.
Compuestos con grupos
funcionales no detectables
Compuestos no volátiles o
por técnicas
térmicamente lábiles
espectroscópicas o
para los que la
electroquímicas
cromatografía de gases es
empleadas en
inaplicable.
cromatografía de líquidos.
 Equipo instrumental de cromatografía de fluidos
supercríticos.

Parecido al de HPLC con los mismos límtes de temperatura y

presión
•Horno: mantener la columna termostatizada y controlar la
temperatura de la fase móvil.

• Restrictor (contrapresión): mantener la presión en la

columna y convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un
gas, y arrastrarlo al detector.
Un restrictor para columna tubular abierta de 50 -100 μm
consiste en un capilar de 2 -10 cm. De longitud y 5 - 10 μm de
diámetro el cual esta directamente unido al extremo final
de la columna

•Microprocesadores: permiten control de variables

instrumentales.

•Detectores :ionización de llama  respuesta universal a

compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad .
Los espectrómetros de masas se pueden adaptar como
detectores mas fácilmente para SFC que para HPLC.
FASE
Fase móvil
ESTACIONARIA
Columnas abiertas:
similares a las columnas
CO2
de sílice fundida con Disolvente excelente
recubrimientos internos de para moléculas
varios tipos de siloxanos orgánicas no polares.
enlazados y de enlaces
cruzados.
Tc = 31º ; Pc =72.9 atm.
Columnas rellenas. Lo cual permite jugar
con una banda amplia
de temperaturas y
presiones.
APLICACIONES

Separación de:

* Fármacos * Tensoactivos

* Alimentos * Polimeros
* Pesticidas * Explosivos
* Herbicidas * Propelentes