PRCTICA # 6 CROMATOGRAFA EN COLUMNA

OBJETIVOS:
Conocer la cromatografa en columna como tcnica de separacin de mezclas de sustancias, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen. Utilizar la cromatografa en columna para la purificacin de una sustancia contaminada con un colorante. Controlar con cromatografa en capa fina el proceso de separacin de mezclas por cromatografa en columna.

INTRODUCCIN:
Las tcnicas cromatogrficas se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatogrfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrn. La base de la tcnica es que cuando un determinado soluto interacta con dos fases, una de ellas, habitualmente slida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorcin en fase slida, solubilizacin en cada fase, arrastre por la fase mvil, etc.) que, en ltimo extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es constante, y se denomina coeficiente de reparto. Si en una mezcla, cada componente tiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros, la separacin ser buena. Naturalmente, dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases, as como de las condiciones de la cromatografa. Una de las tcnicas cromatogrficas ms sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada as porque la fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de slice, almina, etc.) extendida para su manejo mecnico sobre un soporte inerte. La fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento, arrastra ms o menos a los componentes de una mezcla en funcin de sus mayores o menores coeficientes de reparto. El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su lugar, y relacionado con l, se emplea el denominado Rf, caracterstico de cada sustancia, definido como la relacin entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase mvil. Las ms insolubles tendrn, en el disolvente empleado, un Rf prximo a cero, mientras las ms solubles se acercarn a uno. Cromatografa en columna: Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografa es un tubo de vidrio relleno con una sustancia slida de propiedades adsorbentes constituida por pequeas partculas: gel de slice y almina son las ms usadas. Este relleno es lo que se conoce en cromatografa como la fase estacionaria. A travs de la columna se har pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase mvil. La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequea cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuacin se pasa un flujo de eluyente a travs de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, hacindoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografa. Algunos compuestos se ven ms fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarn ms despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarn a mayor velocidad. En general se dice que la separacin en la cromatografa se basa en la afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase mvil o la fase estacionaria.

El orden aproximado de elucin de compuestos y de polaridad es aproximadamente el que se indica:

Cromatografa en Capa fina La separacin de mezclas de molculas mediante la cromatografa de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte slido granulado, tal como gel de slica, alumina, cido silcico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequea cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican aadiendo pequeas gotas de solucin en un pequeo crculo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner ms muestra se pueden aplicar ms gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande. La placa seca se sumerge en un pequeo volumen de fase mvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar. En cromatografa de capa fina la fase estacionaria est hidratada, por lo que se le considera como la fase polar. Como slo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase mvil va arrastrando a las substancias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separacin. La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tia a las substancias de inters. La movilidad relativa o Rf es la relacin entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente. La tcnica de cromatografa en capa fina (TLC), entre otras cosas permite:

Determinar el grado de pureza de un compuesto

Comparar muestras

Realizar el seguimiento de una reaccin Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna
Cromatografa en columna (por fase inversa): Esta es una cromatografa de interaccin en la que la fase estacionaria, con molculas hidrofbicas, interacta con molculas hidrofbicas en la muestra. La matriz consiste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraern a las molculas hidrofbicas de la muestra mientras que las hidroflicas salen con el amortiguador. Las molculas son eludas de la columna lavando con soluciones de distinta concentracin de alcohol o cualquier otro solvente no polar. = PARTE EXPERIMENTAL= MATERIAL: Frasco vial de 15 ml 8 Colector Placas p/cromatografa 10 Embudo de vidrio (portaobjetos) 2 Pipeta Pasteur 1 1 1

Vasos de pp. de 250 ml Vasos de pp. de 150 ml Pinzas de 3 dedos c/nuez Bao mara. elctrico c/extensin Refrigerante de agua c/mangueras Matraz pera de una boca T de destilacin Tapn quickfit SUSTANCIAS:

1 2 1 1 1 1 1

Esptula Columna p/cromatografa Frasco cmara Probeta de 25 ml Varilla de vidrio(50 cm. de longitud) Capilares Algodn Lmpara de luz U.V

1 1 3 1 1 4

Azul de metileno gel de slice para columna gel de slice p/cromatografa en capa fina acetato de etilo hexano sulfato de sodio anhidro yodo EQUIPO: Rotavapor, Parrilla de calentamiento.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Se le proporcionar 0.5026 g de una mezcla de cido benzico/azul de metileno, de la cual separar el

producto principal, por cromatografa en columna. Para empacar la columna sujtela en el soporte con las pinzas. Engrase la llave y mantngala en posicin de cerrado.

Prepare una suspensin de 10g de almina para columna en 10mL de AcOEt y agite durante 5 minutos
para eliminar las burbujas.

A travs del embudo vierta la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que
el empacado sea uniforme.

Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la almina. En el vaso de 150 mL disuelva la mezcla problema con la mnima cantidad de AcOEt, y ayudndose con
el agitador virtala con cuidado, para que quede colocada uniformemente por encima de la almina, abra la llave para que salga el eluyente y se adsorba la muestra aplicada, cuidando que no se seque la almina, eluya la mezcla con AcOEt. Agregue 0.5cm de Na2SO4. cada una de las fracciones ante una muestra de referencia (testigo).

Colecte las fracciones (eluatos) de 10 mL de los frascos viales y controle la separacin, haciendo c.c.f. a Eluya las cromatoplacas en mezcla de Hexano-Acetato de Etilo (1:1), revele con luz U.V. En cada cromatoplaca observe el cambio de la intensidad de la coloracin de la mancha del producto
principal. La elucin y la separacin terminan en el momento en que no aparece mancha.

En un matraz rena las fracciones que contienen la misma sustancia.

Para recuperar la sustancia destile el exceso de disolvente, utilizando una destilacin simple, calentando con un bao mara elctrico, deje en el matraz pera un residuo de 5 mL aproximadamente y virtalo en un vaso que termine de evaporar en la campana.

Pese el producto recuperado, calcule el rendimiento.

RESULTADOS: Matraces: Se realizaron 6 eluatos:

Placas: (s = testigo de cido benzico), eluyente: Hex /AcOet (6:4)

Ya que solo subieron las muestras 1, 2 y 3, estas fueron las que se mezclaron y se aplico la destilacin simple, para obtener la muestra final de ac. Benzico. Muestra original: 0.5026g Muestra pesada: 0.2521g

%R =

0.2521g 100 = 50.16% 0.5026 g

DISCUSIN DE RESULTADOS: Se utiliz la tcnica de cromatografa en columna para separar individualmente al cido benzico de el azul de metileno con el que se encontraba mezclado, identificndolo comparando su comportamiento cromatogrfico con el de la sustancia patrn de cido benzico puro eluido en AcOet. Se realizaron 6 eluatos de entre 10ml cada uno que se colocaron en 3 cromatoplacas para realizar cromatografa en capa fina, 2 por cada una y en medio se coloc el testigo de cido benzico para determinar dependiendo de las muestras que subieran en cules de ellas exista an cido benzico. En las muestras 1 y 2 fue en las que se observ ms muestra, tambin en la 3, pero ya era mnima la cantidad y en la 4 apenas se observaba un pequeo punto, la 5 y la 6 ya no se observaba muestra, as que se mezclaron las muestras 1,2 y 3, para despus separar el eluyente del cido por destilacin simple y as obtuvimos una muestra final de 0.2521g de una muestra inicial de 0.5026g con un rendimiento del 50.16%, esto posiblemente debido a que la muestra inicial contena demasiado azul de metileno mezclado en ella y esta parte se quedo en la columna, o tambin existe la posibilidad de que el eluato 4 tuviera tambin un poco ms de muestra, aunque hubiese sido mnima ya que en la placa no se observo que hubiese gran cantidad de muestra, por lo que obtuvimos ese rendimiento de la mitad de la muestra original. En cuanto al azul de metileno, este quedo retenido por el adsorbente (fase estacionaria), lo que permiti separarlo del acido benzico. CUESTIONARIO:
1. Si una mezcla de antraceno y naftaleno se separa por cromatografa sobre almina, cul de los dos hidrocarburos eluir primero y cul al ltimo? Cul sera el ms polar? Primero eluir el antraceno

luego el naftaleno debido a que el primero es mas polar que el segundo esto es originado por la triple estructura cclica-aromtica sobre la doble estructura cclica-aromtica del segundo
2. Un colorante desconocido, se piensa que puede ser azul de metileno, cmo se podra comprobar esta suposicin usando un procedimiento basado en una tcnica cromatogrfica? Por medio de la

separacin de las diferentes fases adems de utilizar los disolventes que sean los ms adecuados para disolver este colorante por medio de cromatografa en capa fina identificando el nmero de fases correspondiente al azul de metileno y si stas fases corren igual al ser comparadas con un testigo de azul de metileno, podra tratarse de la misma sustancia.
3. Qu debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una cromatografa en columna? De acuerdo a la polaridad de la muestra se determina la polaridad del eluyente y

determinar las dems fases que rodean la columna para evitar que la muestra no se desplace ms de lo necesario
4.- La recuperacin cuantitativa del producto principal, sera ms completa si se recogieran fracciones mayores o menores de 10 mL? Por qu? Mayores de 10 ml para que mayor parte de la muestra

pase por la columna y as se juntaran las fases para realizar la destilacin y obtuviramos mayor cantidad de muestra final
5. Indique alguna de las aplicaciones de la cromatografa de adsorcin en columna y capa fina

Capa fina : separacin de aminocidos Columna : separacin de colorantes, protenas

6. Escriba la ficha bibliogrfica completa de 5 libros de cromatografa en capa fina y columna (tcnica y teora) especializada:

ABBOTT,

David y ANDREWS, R. S. Introduccin a la Cromatografa. 3ra. Edicin. Coleccin Exedra. Editorial Alhambra. Espaa. 1973.

BAUER, Karin ; GROS, Leo and SAUER, Werner. Thin Layer Chromatography: An Introduction. Hthig
Verlag. Germany. 1991 BROWNING, D. R. Cromatografa-Toray-Masson. Espaa. 1971. DOMINGUEZ, Xorge Alejandro. Cromatografa en Papel y en Capa Delgada. Serie de Qumica. Organizacin de los Estados Americanos. N 16. U.S.A. 1975 GTZ, Wolfgang; SACHS, Albert and WIMMER, Hans. Thin-Layer Chromatography. Gustav Fisher. Verlag. Germany. 1980.

JORK, H and WIMMER H. TLC Report: A Collection of Quantitative Papers. GIT Verlag. Germany. 1986. Reactivos de Coloracin para Cromatografa en Capa Fina y en Papel. Merck. Alemania. 1980. ZLATKIS, A. and KAISER, R.E. HPTLC. High Performance Thin-Layer Chromatography.
of Chromatography Library. Elsevier. 1977. 7. Cul es la diferencia entre cromatografa en capa fina y la cromatografa en papel.

TOUCHSTONE, Joseph and DOBBINS, Murrell F. Practice of Thin Layer Chromatography. 2nd Edition. Willey Interscience. U.S.A. 1983. Vol. 9. Journal

Igual que la realizada en papel, la cromatografa en capa fina se basa en la distribucin en dos fases, la estacionaria, compuesta por una capa de hidratacin y la mvil, que se trata de un solvente orgnico. La nica novedad radica en el soporte, ya que no es una hoja de papel, sino una capa de 0,1 a 1 mm de xido de silcico o celulosa, apoyada en un subsoporte de cristal. La capa se aplica manualmente mediante un aparato que deja una ranura regable por la que sale la pasta denominada Silicagen, este aparato la vamos deslizando por la placa a velocidad constante para conseguir la textura deseada, no hay que decir que a mayor velocidad menor grosor de la capa. Siempre se realiza de forma ascendente, principalmente por que el soporte es rgido. La cromatografa en capa fina aguanta tratamientos de visualizacin mucho ms potentes debido al subsoporte y que es ms rpida, pudiendo terminar la corrida en una media hora.
8. Indique la toxicidad de las sustancias que utiliz y como se podran desechar:

AZUL de METILENO: C16H18ClN3S . 3H2O PM: 373,9 anhidro. (PM: 319,9) Cloruro de metiltioninium, colorante azul antisptico utilizado en aplicaciones locales en la piel y en las mucosas, y por va bucal como desinfectante urinario. Cristales o polvo cristalino de color verde oscuro, con brillo bronceado. Inodoro o prcticamente inodoro. Estable al aire. Sus soluciones en agua o en alcohol, son de color azul profundo. Soluble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol. Toxicologa: reacciones de hipersensibilidad (alergia), tales como ronchas en la piel, hinchazn, dificultad para respirar.irritacin local, sensacin de quemaduras, picazn. Los sntomas de sobredosis corresponden a una intensificacin de los efectos adversos descritos, tales como: ansiedad, dolor en el pecho, dificultad para respirar, confusin, dolor de cabeza, dolor de piernas, nauseas, vmitos. Debe recurrir a un centro asistencial para evaluar la gravedad de la intoxicacin y tratarla adecuadamente. ACETATO DE ETILO: Lquido incoloro, de olor caracterstico. El vapor es ms denso que el aire y puede extenderse a ras del suelo; posible ignicin en punto distante; El calentamiento intenso puede originar combustin violenta o explosin. La sustancia se descompone bajo la influencia de luz UV, bases y cidos. La solucin en agua es un cido dbil. Reacciona con oxidantes fuertes, bases o cidos. Ataca muchos metales en presencia de agua. Ataca los plsticos. La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio. La sustancia puede tener efectos sobre el sistema nervioso. La exposicin muy por encima del OEL puede producir la muerte. Se recomienda vigilancia mdica; El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis. ALMINA: La inhalacin de altas concentraciones de polvo de sta sustancia puede originar irritacin de los ojos y tracto respiratorio superior. Barrer la sustancia derramada e introducirla

en un recipiente, eliminar el residuo con agua abundante, Barrer con cuidado para evitar la formacin de polvo. CIDO BENZICO: Es posible la explosin del polvo si se encuentra mezclado con el aire en forma pulverulenta o granular; La disolucin en agua es un cido dbil. Reacciona con oxidantes. La sustancia se puede absorber por inhalacin y por ingestin. No puede indicarse la velocidad a la que se alcanza una concentracin nociva en el aire por evaporacin de esta sustancia a 20C. La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio.; El contacto prolongado o repetido puede producir sensibilizacin de la piel. HEXANO: Por evaporacin de esta sustancia a 20C se puede alcanzar bastante rpidamente una concentracin nociva en el aire. La sustancia irrita los ojos. La ingestin del lquido puede originar aspiracin dentro de los pulmones con riesgo de neumonitis qumica. La sustancia puede causar efectos en el sistema nervioso central. El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis. El lquido desengrasa la piel. La sustancia puede afectar al sistema nervioso perifrico, dando lugar a polineuropatas. Puede originar lesin gentica en los seres humanos. La experimentacin animal muestra que esta sustancia posiblemente cause efectos txicos en la reproduccin humana. CONCLUSIONES: En esta prctica se realiz la separacin por columna de una mezcla de azul de metileno con cido benzico para obtener fracciones (eluatos) colectadas y despus por cromatografa en capa fina compararlas con una muestra testigo para poder identificar los eluatos que contenan cido benzico y por destilacin simple obtener la muestra deseada que era de cido benzico La cromatografa por columna se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias, reteniendo en su fase estacionaria (en este caso la almina) a algunos compuestos por su propiedad de adsorcin, por la que a travs de ella se har pasar una corriente de disolventes o mezcla de disolventes (fase mvil : eluyente) que arrastrar a los compuestos constituyentes de la mezcla, hacindoles avanzar a travs de la columna. Este tipo de cromatografa se utiliza para saber en que recipientes se encuentra un componente buscado y para determinar la cantidad de este cuantitativamente, contrario a la cromatografa por capa fina donde solo se puede hacer un anlisis cuantitativo. BIBLIOGRAFA: http://depa.pquim.unam.mx(9/oct/2006)

http://www.fq.uh.cu/dpto/qi/Aimee/sintesis_inor_web/conf_3.htm (28/ago/2006) www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm - 22k(Oct/9/2006)

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm(9/oct/2006)