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Universidad de Guadalajara
Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenieras
Departamento de Qumica

Instrumentacin Analtica







Prctica No. 7
Separacin de cido acetilsaliclico y cafena (cafiaspirina) en analgsicos por
Cromatografa de Lquidos de Alta Precisin








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DATOS PREVIOS
En la cromatografa de lquidos, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna
que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria.
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la
estabilidad trmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales
lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible
para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama
de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.

HPLC Cromatografa lquida de alta resolucin
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas
caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta
presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades
y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o
fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin
de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a
ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad
identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria.
La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los
compuestos dentro de la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la
resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el
acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido
trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.
Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de
la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en
una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de
forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la


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hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una
funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la
fase estacionaria.

HPLC preparativa

Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las industrias
qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica. La cromatografa
preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de
muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de
una mezcla de 100 g.

Aplicaciones:

Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos.
Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos.
Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos.
Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores,
colorantes.
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB.
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos.
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.


Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

Separacin y purificacin de metabolitos.
Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
orina.
Purificacin y separacin de enantimeros.
Purificacin de compuestos naturales.
Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas.




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Mecanismos de separacin en cromatografa

El principio para que se separe una muestra en sus componentes puede ser debido a 5 principales
fenmenos fsicos:

1. Adsorcin. En este mecanismo se utiliza una fase estacionaria porosa, con un rea
superficial muy grande (por ejemplo, carbn activado o slica gel). El soluto se adsorbe en la
superficie de la fase estacionaria. La causa de que se mantenga adsorbido el soluto se debe a
la separacin de este a lo largo de la superficie de la fase estacionaria.
La cromatografa de adsorcin o Lquido-Slido es la forma clsica de la cromatografa de
lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un mtodo importante
de la HPLC.
Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina,
siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con
masas moleculares inferiores a 5 000. Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y
reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.

2. Reparto. La fase estacionaria es una pelcula delgada fija sobre un soporte slido
previamente preparado. El soluto se separa por el equilibrio que se establece por la
solubilidad que tenga el soluto frente a este lquido estacionario y a la fase mvil gaseosa o
lquida.

3. Intercambio Inico. Para que se efecte la separacin, la fase estacionaria se modifica
uniendo a su superficie especies electro activas (aniones o cationes) de forma covalente.

4. Exclusin molecular. Esta separacin se debe al tamao del componente de la muestra.
Se asemeja a un tamiz molecular, en el cual la fase estacionaria es un gel poroso que


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atrapa a las partculas pequeas del soluto, mientras que las grandes, no caben por los poros
de este gel y pasan de largo sin ser retenidos.
Es una tcnica reproducible, escalable y rpida. La fase fija est formada por partculas
polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar
las molculas de pequeo tamao.

5. Afinidad. Es la tcnica ms reciente y ms selectiva. Se inmovilizan molculas (como
enzimas y anticuerpos) sobre la superficie de la fase estacionaria. Los componentes de la
muestra altamente afines a estas molculas se retienen con gran eficacia mientras las que no
son afines, pasan de largo a travs de la columna y salen en primera instancia.



Cromatografa de columna

El proceso que consiste en hacer pasar un lquido o un gas a lo largo de una columna
cromatogrfica se denomina elucin. Como se observa en la figura 9, la fase mvil que entra a
la columna se llama eluente. Al salir de la columna se llama eluato o efluente.



Diferencia entre eluente y eluato

Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin ptima,
los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la
mezcla separada.









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Parmetros que pueden identificarse en un cromatograma

Tiempo muerto (

): Tiempo de retencin para un soluto inerte, que no sea retenido en la

columna. Notar que tm es en realidad el tiempo necesario para que la fase mvil recorra la
longitud de la columna. En los cromatogramas reales, tm no siempre aparece. En
cromatografa de gases, cuando se usa un detector de ionizacin de flama, puede inyectarse
aire junto con la muestra para que aparezca el pico de aire correspondiente al tiempo muerto.
El volumen de la fase mvil necesario para desplazar un soluto no retenido desde el inyector
al detector se conoce como volumen muerto (Vm) o volumen de la fase mvil en la columna.

Tiempo de retencin corregido (

): Diferencia entre el tiempo de retencin y el tiempo

muerto.

Si todos los componentes de la mezcla interaccionan con la fase estacionaria, ninguno de
ellos eluir al volumen de retencin. Puede darse el caso de que el pico correspondiente al
tiempo muerto no aparezca tampoco en el caso de que el detector no sea sensible a ese
compuesto.
Tiempo de retencin (

): Tiempo necesario despus de la inyeccin de la mezcla para que

la muestra alcance el detector. Manteniendo las mismas condiciones experimentales, cada
substancia tendr su propio tiempo de retencin, nico y caracterstico de ella. El tiempo de
retencin se mide desde el inicio de la inyeccin hasta la parte ms alta del pico
cromatogrfico.
Factor de retencin (k): Tambin llamado factor de capacidad, se define como la relacin
entre el tiempo de retencin corregido y el tiempo muerto.

Retencin relativa ( ) Para caracterizar las distancias entre los mximos de dos picos
cromatogrficos consecutivos, se utiliza el factor de selectividad o de retencin relativa,
definido como la razn entre el tiempo de retencin neto de los dos componentes, que puede
calcularse directamente del cromatograma.
Resolucin (Rs) El objetivo principal de la cromatografa es separar una mezcla en sus
componentes en un periodo de tiempo razonable. La Resolucin es la separacin entre los


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picos de un cromatograma, lo que implica que se pueda observar mejor la concentracin de
cada componente.
PARMETROS INSTRUMENTALES
Columna
Lichrocart 250-4 C 18
1508390001
Fase mvil Metanol-agua HPLC 50-50%
Flujo 8ml/min, presin 3000 psi
Detector

Dimetro interno
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad
de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las
columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin
de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno
menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el
aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan. Estas
columnas se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a
un detector UV-VIS.
Medida de las partculas
La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de
partculas esfricas de slice. Estas partculas pueden tener diferentes medidas, siendo las de
5 m de dimetro las ms utilizadas. Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y
una mejor separacin, pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima
aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula. Esto
significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la
columna, pero a la vez, aumentara la presin necesaria en un factor de ocho.
Tamao de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros
pequeos proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida
proporcionan una cintica mejor, especialmente para los compuestos de tamao ms grande;
por ejemplo, una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros
puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.



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Presin del sistema
La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante, pero su rendimiento se
mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presin puede lograr
valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmsferas). Los aparatos ms modernos de HPLC
incorporan mejoras para poder trabajar a presiones ms altas y, por lo tanto, poder utilizar
partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrmetros).

DATOS OBTENIDOS
Cromatogramas de estndares puros
cido acetil saliclico Cafena


















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Cromatograma de muestra problema.

























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CLCULOS
Clculos para preparacin de la muestra
Cada comprimido contiene:
Aspirina: 500 mg
Cafena: 40 mg

Cada comprimido de cafiaspirina pes 640.5 mg, se tom (1/10) del comprimido (64.05 mg) y
se aforo en un matraz a 25 ml (solucin madre), la solucin madre se diluy 1/10 y de nuevo
se diluy 5/100 para llegar a una concentracin de AAS cercana a 10 ppm.

(


) (

)

Se aforaron en un matraz de 25 ml:




(

) (

)

Clculos para obtener resultado final
, ,

.
Clculo de Retencin relativa
El profesor nos proporcion el tiempo de muerto.

Tiempo de retencin corregido del AAS

, tiempo de retencin corregido de la cafena

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Clculo de Factor de retencin K

Clculo de los nmeros de platos tericos N

Clculo de la altura equivalente a un plato terico (AEPT)

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Resolucin entre los dos compuestos

(

( )




F.A. y F.C.

Clculos para encontrar el porcentaje % del compuesto presente en el producto
comercial
AAS

)(

)


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)( )
(

) (

)


( )
(

)




En el comprimido se obtuvo 432.7 mg de cido acetil saliclico, 86.54 % de 500 mg que dice
tener presente el comprimido de cafiaspirina de Bayer.

Cafena

)(

)( )
(

) (

)


( )


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(

)



En el comprimido se obtuvo 35.62 mg de cafena, 89.05 % de 40 mg que dice tener presente
el comprimido de cafiaspirina de Bayer.


RESULTADOS

ANEXOS
La columna
Debe estar construida en acero inoxidable para resistir la presin. La columna es un tubo de
acero de 10 a 30 cm de largo y 2 a 5 mm de dimetro interior, empacada con la fase
estacionaria. Algunos cromatgrafos tienen la columna en posicin vertical, otros horizontal, y
generalmente se encuentra en el exterior del aparato, a temperatura ambiente.


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Tipos de columnas HPLC

La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna
diseada para separar y clasificar los componentes de una muestra sobre la base de sus
interacciones con una columna especfica. HPLC es distinta, ya que utiliza un entorno ms
presurizado para propulsar las muestras lquidas a travs de la densa columna de manera
ms eficiente. Tres tipos de columnas de HPLC estn en uso comn hoy en da, pero difieren
en la naturaleza de la capa de material que recubre la columna e interacta con la muestra.

Columna de intercambio inico

Los experimentadores utilizan cromatografa de intercambio inico al separar muestras
ionizables, o muestras que se puede cargar. La fase estacionaria, que es el material slido
que recubre la columna e interacta con la muestra, posee una carga opuesta a la de la
muestra de inters, de manera que la muestra ser atrada a las paredes de la columna. Esta
atraccin ralentiza el tiempo de elucin e la muestra, o el tiempo que se necesita para pasar
todo la columna en la fase mvil. Mientras ms cargadas estn las partculas de la muestra,
ms atradas estarn por la fase estacionaria, lo que resulta en un tiempo de elucin ms
lento. El tiempo de elucin representan la intensidad de la carga de las partculas, y por lo
tanto es el medio principal de clasificacin de los distintos compuestos dentro de la muestra.

Columna de adsorcin

Como su nombre lo indica, la cromatografa de adsorcin funciona a travs de una fase
estacionaria adsorbente. La adsorcin, que no debe confundirse con la absorcin, implica la
unin temporal de las partculas de la muestra a la fase estacionaria de la columna. El grado
en el que una partcula de la muestra puede adsorberse a la fase estacionaria est
determinada por la polaridad relativa, o carga, que la partcula puede poseer en un momento
dado. Esto vara de la cromatografa de intercambio inico en que las partculas no se cargan
de manera explcita, sino que a veces son ligeramente positivas o negativas a medida que la
partcula gira y vibra. Mientras la partcula se mueve hacia abajo en la columna, se adsorbe y
de-adsorbe en diversos grados en funcin del nivel de polaridad que posee. Los tiempos de
elucin proporcionan una medida del nivel de polaridad de las partculas de la muestra.



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Columna de exclusin por tamao
La cromatografa de exclusin por tamao utiliza una tcnica de separacin diferente a la de
intercambio inico o de adsorcin. Este tipo de columna es menos comn que las otras dos,
pero es til cuando se separan biomolculas grandes como protenas o hidratos de carbono.
La fase estacionaria se compone de partculas no cargadas, que son de tamaos controlados
y porosos. Cuando la muestra se dispara a travs de la columna, las partculas de tamao
ms pequeo son absorbidos temporalmente en el recubrimiento de la columna, mientras que
las partculas ms grandes pasan directamente a travs de l y se eluyen primero. La fase
estacionaria est diseada de manera que cuanto ms pequea sea la partcula, ms
profundamente penetra en el recubrimiento de la columna, lo que significa que a las partculas
ms pequeas les tomar la mayor cantidad de tiempo para volver a la superficie y eluir. Las
muestras se pueden clasificar de acuerdo con el tiempo de elucin, lo que se corresponde
directamente con tamao de partcula.

Problemas ms comunes encontrados en HPLC


Presin Alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partculas.
Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del
detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presin
sigue alta reemplace la columna.
Solucin a largo plazo: Asegrese que todas las fases mviles se filtren apropiamente antes
que entren a la bomba de HPLC. Tambin filtre todas las muestras antes de inyectarlas.

Prdida de la Resolucin
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del Guarda Columna por partculas.
Solucin: vea la seccin de Presin Alta
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles en el sistema
de HPLC.

Picos Hendidos
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partculas.
Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est al lado de abre. Si es necesario
reemplace el fritado de la entrada o la columna.
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles en el sistema


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de HPLC.

Variacin en los Tiempos de Retencin

Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase mvil.
Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles es propiamente [degassed].
Solucin a larga plazo: Asegrese fase tan mvil est propiamente y adecuadamente
desgasificada. Si usa desgasificacin electrnica en lnea asegura esa cadencia del flujo no
es demasiado alto para evita [degassing] completo.

Variaciones de la Lnea Base
Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala
desgasificacin de los solventes de la fase mvil.
Solucin: Asegrese que todas las fases mviles estn debidamente desgasificadas y
considerar el uso de un restrictor de la presin a toma de corriente del detector.

Lnea Base con mucho Ruido
Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
Solucin: Enjuague el sistema y purgue la bomba de HPLC. Use Solventes desgasificados
adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase mvil del sistema.

Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia)
Posible causa: Oxgeno Disuelto.
Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la concentracin de
oxgeno disuelto.
Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea. Peridicamente
chequear el nivel de oxgeno disuelto.

Baja Ninguna Presin
Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho tiempo a
partculas en suspencin en la fase mvil.
Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.


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TIPOS DE DETECTORES

Espectrometra de masas

El detector de espectrometra de masas junto con la HPLC se denomina HPLC-MS (por sus
siglas en ingls). ste forma uno de los mejores conjuntos analticos. El HPLC-MS es el
detector ms potente. Tiene particularmente relevancia dentro del mbito de la ciencia mdica
y es ampliamente utilizado en laboratorios farmacuticos y en la investigacin y el desarrollo.
El principal beneficio del HPLC-MS es su capacidad de analizar y proporcionar la identidad
molecular de un amplio rango de componentes.
Deteccin del ndice de refraccin (IR)

El detector del ndice de refraccin (IR) utiliza un monocromador y es uno de los detectores
LC menos sensibles. Es extremadamente til para detectar aquellos componentes que son no
inicos. No absorbe la luz ultravioleta y no se torna fluorescente. Algunas muestras que se
examinan con este detector son el azcar, el alcohol, los cidos grasos y los polmeros.

Ultravioleta (UV)

Los detectores ultravioleta (UV) son econmicos y populares y son ampliamente utilizados en
la industria. Este tipo de detector responde a sustancias que absorben luz. El detector de UV
es principalmente utilizado en las ciencias biomdica y farmacutica para separar e identificar
los principales componentes activos de una mezcla. Los detectores de UV son los ms
verstiles, ya que cuentan con la mayor sensibilidad y linealidad. Los detectores de UV no
pueden utilizarse para probar sustancias bajas en cromforos (incoloros o prcticamente
incoloros) ya que no pueden absorber luz en rangos bajos.
Fluorescencia

La fluorescencia es el detector de HPLC ms sensible. Se utiliza prcticamente de manera
exclusiva en la cromatografa lquida (LC). Se trata de un detector especfico que detecta


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solamente aquellas sustancias que emiten luz. Este detector es popular en el anlisis de
trazas dentro de la ciencia ambiental. Como es muy sensible, su respuesta es solamente
lineal sobre un rango de concentracin relativamente limitado. Como no hay muchos
elementos que se tornan fluorescentes, los cientficos necesitan sintetizar muestras para que
sean detectables.
Mediciones para clculos.


CONCLUSIONES

La cromatografa HPLC es una tcnica de separacin que nos permite identificar de manera exacta y
precisa la composicin de una muestra y la concentracin de sus componentes. Es de gran utilidad
para muchas areas de estudio y de la industria.


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REFERENCIAS

1. Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) "High capacity and low cost detection of prion
protein gene variant alleles by denaturing HPLC". Jorunal of Neuroscience Methods, 139:263-269.
3. McNAIR, Harold y ESQUIVEL, Benjamin. Cromatografa Lquida de Alta Presin. N 10. Serie
Qumica. Organizacin de los Estados Americanos. Washington. 1973.

4. Cromatografa, Apuntes de instrumentacin analtica. Bernardo Gudio.

5. http://www.ehowenespanol.com/tipos-detectores-hplc-lista_92703/
6. http://latina.chem.cinvestav.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm#Problemas
7. http://www.slideshare.net/ivvivarchavsky/hplc-15483718