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3.- Prueba de Elisa Para La Deteccion de Vih Tipo 1 y 2

3.- Prueba de Elisa Para La Deteccion de Vih Tipo 1 y 2

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Existen dos pruebas que se utilizan para diagnosticar la infección causada por el VIH: una detecta la presencia de anticuerpos específicos frente al VIH, que el organismo produce como respuesta al virus, y la otra identifica la presencia del virus propiamente dicho.

La relación de "acoplamiento" ("llave-cerradura") entre los anticuerpos (Y) y el virus es la base del ELISA.

Existen dos pruebas que se utilizan para diagnosticar la infección causada por el VIH: una detecta la presencia de anticuerpos específicos frente al VIH, que el organismo produce como respuesta al virus, y la otra identifica la presencia del virus propiamente dicho.

La relación de "acoplamiento" ("llave-cerradura") entre los anticuerpos (Y) y el virus es la base del ELISA.

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PRÁCTICA No.

3 “ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 Y 2” INTRODUCCIÓN VIH es la abreviatura de virus de la inmunodeficiencia humana, el virus que causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La infección por el VIH conduce a una destrucción gradual del sistema inmunitario y a un aumento de la sensibilidad a las infecciones oportunistas. El 80 % de los pacientes infectados por el VIH mueren debido a una infección diferente a la producida por este virus. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus identificado en 1983 como agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El virus de VIH consiste en una molécula de RNA genómica asociada con transcriptasa reversa (TR), protegida con una cápside y una envoltura. Los 2 tipos de VIH-1 y VIH-2 exhiben diferentes pronósticos y grados de transmisión que los distinguen. VIH El VIH es un lentivirus, un tipo de retrovirus que pertenece a la categoría de los virus asociados con enfermedades inmunosupresoras en mamíferos que afectan a los sistemas hematopoyético y nervioso central. El VIH-1 es el responsable del tipo de infección más frecuente. El VIH-2 se identificó en África occidental en 1986 y se ha aislado posteriormente en Europa, Suramérica, Canadá y Estados Unidos. Métodos de transmisión del VIH El VIH se ha encontrado en semen, sangre, liquido amniótico, pericárdico, peritoneal, pleural, sinovial, tejido del sistema nervioso, leche materna y secreciones vaginales. El VIH puede contagiarse por:  Contacto sexual (p. ej., relación sexual oral, vaginal o anal)  Contacto con sangre (es decir, a través de transfusiones de sangre, uso compartido de agujas y jeringas para administración intravenosa de drogas, heridas y úlceras abiertas) o por transplante de órganos o tejidos infectados.  De las mujeres a sus hijos, durante el embarazo, el parto o la lactancia natural Infección El VIH busca células del sistema inmunitario que tengan receptores de superficie CD4, porque este receptor especial permite al virus unirse a la célula; es a los primeros que ataca. Aunque el VIH infecta a varias células del sistema inmunitario, tiene preferencia por el linfocito T, un leucocito que posee numerosos receptores CD4. El decremento progresivo de CD4 durante el desarrollo de la enfermedad facilita las infecciones oportunistas con fatales consecuencias. Replicación Después de unirse a la célula CD4+, el VIH transfiere su material genético y enzimas vitales al interior de la célula, donde se integra con el material genético de la célula huésped, produciéndose una nueva generación de VIH. En el interior del virus El VIH es una estructura muy simple constituida por material genético y enzimas esenciales rodeados por una cubierta proteica contenida en una envoltura viral. Cápside - Cubierta proteica que protege al material genético (ARN) y las enzimas clave del virus. Integrasa - Enzima que ayuda a integrar el material genético del VIH en el ADN de la célula huésped durante la replicación viral.

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ARN - El ARN contiene el código genético necesario para crear nuevos virus ARN (VIH). El VIH contiene dos cadenas idénticas de ARN. Proteína gp 120 - Las proteínas gp 120 son pequeñas protuberancias en la superficie del virus (VIH). Ayudan a éste a unirse a las células que tienen receptores CD4. Transcriptasa reversa - Esta enzima es necesaria para convertir el material genético del VIH (es decir, el ARN) en ADN viral, lo que permite al virus integrar su material genético en el ADN de la célula huésped. Envoltura - Capa externa del virus en la que están incrustadas las proteínas gp 120. Proteasa - Enzima que corta las cadenas de proteínas para prepararlas para el ensamblaje en partículas virales. Prueba del VIH El VIH es el virus que debilita el sistema inmunitario y produce el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Existen dos pruebas que se utilizan para diagnosticar la infección causada por el VIH: una detecta la presencia de anticuerpos específicos frente al VIH, que el organismo produce como respuesta al virus, y la otra identifica la presencia del virus propiamente dicho. La relación de "acoplamiento" ("llave-cerradura") entre los anticuerpos (Y) y el virus es la base del ELISA. Es fundamental que los individuos infectados por el VIH conozcan y entiendan su enfermedad y sus implicaciones, de modo que puedan reducir el riesgo de transmisión del virus a otros e iniciar el tratamiento médico adecuado. Lamentablemente, muchas personas infectadas por el VIH no saben que padecen la enfermedad hasta que experimentan síntomas físicos evidentes. Si usted o su médico tienen razones para sospechar que está infectado por el VIH, se le recomendará la realización de una prueba llamada ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) que detecta la presencia de anticuerpos contra el VIH en la sangre (véase la ilustración anterior). Los anticuerpos son proteínas que combaten la enfermedad, creadas por el sistema inmunitario en respuesta a la infección. Un resultado positivo significa que el sistema inmunitario ha producido anticuerpos en respuesta a la infección por el VIH. Este resultado debe confirmarse con otra prueba llamada Western Blot. Síntomas físicos VIHMuchas personas no presentan síntomas evidentes inmediatamente después de infectarse por el VIH. Sin embargo, al cabo de tres a seis semanas, aproximadamente el 50-70 % de las personas desarrollan un síndrome agudo por VIH, cuyos síntomas duran alrededor de una semana y consisten en fiebre, dolor de garganta, cansancio, pérdida de apetito, náusea, vómito y diarrea. Las personas pueden desconocer que están infectados por el VIH, ya que estos síntomas acompañan habitualmente al resfriado común. La historia interna Durante la etapa de infección primaria, la carga viral aumenta al máximo a medida que el virus (VIH) se extiende por el organismo, especialmente al tejido linfoide. Después, la carga viral comienza a descender a medida que el sistema inmunitario responde a la infección. La cuenta de células CD4 desciende bruscamente durante la infección primaria porque el VIH destruye indirectamente la población de células durante el proceso de replicación viral. Posible causas de resultados falsos, positivos y negativos, de las pruebas EIA que se recogen en la siguiente tabla. FALSOS POSITIVOS DE LOS EIA FALSOS NEGATIVOS DE LOS EIA

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Interferencia de

Anticuerpos como los que se dirigen frente antígenos de músculo liso, células parietales, mitocondriales, nucleares, leucocitarios y de células T. Presencia de anticuerpos IgM frente al core del virus B de la hepatitis y frente al virus A de la hepatitis Anticuerpos frente a antígenos leucocitarios de clase II de células H9 que pueden estar presentes en mujeres embarazadas multíparas y sujetos politransfundidos.

Periodo de incubación de la infección o enfermedad aguda antes de la seroconversión (periodo ventana)

Enfermedades del hígado como hepatopatia alcohólica grave, cirrosis biliar primaria o colangitis esclerosante Inactivación del suero por calor o positividad a RPR (reagínas plasmáticas) Procesos hematológicos malignos, como linfomas Infección por VIH-2 u otros retrovirus Infecciones agudas por virus ADN Vacunación contra la gripe Insuficiencia renal crónica y transplante renal Síndrome de Steve-Johnson Anticuerpos anti-VIH-1 adquiridos de forma pasiva, por ejemplo mediante inmunoglobulinas.

Tratamientos inmunosupresores intensivos o prolongados Procesos malignos Transfusión de reposición Transplante de médula ósea Disfunciones de las células B Interferencia de factores reumatoideos Equipos que detectan principalmente anti-p24 Pérdida de estabilidad de los componentes del equipo de reactivos

Síntomas generales del síndrome agudo por VIH:

Fiebre Infección de garganta Ganglios linfáticos inflamados Cefalea Dolor articular o muscular Fatiga o pérdida de energía Anorexia o pérdida de peso Náusea, vómito, diarrea Trastornos cutáneos, como erupción y ulceración, y del sistema nervioso, como meningitis y encefalitis.
INSERTO Genie II HIV-1/HIV-2 V2, es un ensayo inmunoenzimatico (EIA) de reconocimiento dual, basado en la detección especifica de anticuerpos anti VIH-1 y anti VIH-2 por anfígenos con inmunoreactividad mejorada que se unen a ambos sitios de unión de los anticuerpos. La prueba incorpora una combinación de inmunocromatografia e inmunoconcentración. El cartucho de reacción contiene 2 compartimentos uno circular A, para la adición de la muestra: y uno más grande, elíptico de Reacción B. Los antígenos derivados de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizados en dos puntos separados en la zona de reacción del compartimento B.

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Al comenzar la prueba, una muestra diluida es introducida en el compartimento A. Si están presentes anticuerpos anti VIH en la muestra, se unen específicamente a los antígenos VIH en un paso de reconocimiento dual. El complejo resultante reacciona con el conjugado estreptavidina/fosfatasa alcalina (AP). La visualización de los resultados como manchas gris azul es acompañada por la reacción de sustrato cromógeno. La solución de paro es adicional al final de la reacción. La aparición de 2 o 3 manchas gris azul de reacción en el compartimento B, indica la presencia de anticuerpos contra VIH. En un resultado negativo solo el control interno será visible. Contenido del equipo: Equipo: 20 pruebas 20 cartuchos de reacción Genie II HIV-1/HIV-2 V2 22 microtubos para dilución de la muestra Componentes. Antígenos: HIV-1: proteína recombinante gp41 Péptido gp41 HIV-2: proteína recombinante p24 Péptido gp36 Reactivos: Numero de reactivo 1 2 3 4 5 Controles: Control positivo: 1 vial, con 0.5 ml de plasma humano diluido, positivo para VIH-1 y para VIH-2, inactivado por adición de B-propiolactona y por tratamiento con calor. El control positivo ha sido probado y encontrado no reactivo para antígeno de superficie de hepatitis B y anticuerpos contra virus de la hepatitis C. Control Negativo. 1 vial con 0.5 ml de plasma humano, diluido inactivado por calor. El control negativo ha sido encontrado no reactivo para antígeno de superficie de hepatitis y anticuerpos contra virus de la hepatitis C, y anticuerpos contra virus de inmunodeficiencia humana. Datos:      Genie HIV-1/HIV-2 Lote 200807160001; Caducidad: 06/09/09 Control positivo Lote 200907080157; Caducidad: 22/09/09 Control negativo Lote 200907080156; Caducidad: 22/09/09 Diluyente Lote 2008051600026; Caducidad: 06/09/09 Sol. Lavado Lote 20085160004; Caducidad 06/09/09 Nombre de reactivo Diluyente de muestras Conjugado estreptavidina/AP Solución de lavado Sustrato cromógeno Solución de paro Control positivo Control negativo Contenido frascos 20 y 40 pbas 1 fco gotero etiqueta blanca 1 fco gotero etiqueta amarilla 1 botella dispensadora etiqueta naranja 1 fco gotero etiqueta azul 1 botella dispensadora etiqueta blanca 1 vial etiqueta roja 1 vial etiqueta verde Volumen 20 y 40 pbas 7 ml 7 ml 50 ml 50 ml 5 ml 0.5 ml 0.5 ml 40 pruebas 40 cartuchos de reacción Genie II HIV-1/HIV-2 V2 22 microtubos para dilución de la muestra 100 pruebas 100 cartuchos de reacción Genie II HIV-1/HIV-2 V2 22 microtubos para dilución de la muestra

100 pbas 3 fcos goteros etiqueta blanca 3 fcos goteros etiqueta amarilla 3 botellas dispensadoras etiqueta naranja 3 fcos goteros etiqueta azul 3 botellas dispensadoras etiqueta blanca 3 viales etiqueta roja 3 viales etiqueta roja

100 pbas 3*7 ml 3*7 ml 3*50 ml 3*50 ml 3*5 ml 3*0.5 ml 3*0.5 ml

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   

Sol. Stop Lote 20085160006; Caducidad: 29/05/09 Streptarvidina Lote 200909091049; Caducidad: 08/02/09 Cromógeno Lote 200909091051; Caducidad: 08/02/09 Placa (cartucho) Lote 200907101811; Caducidad: 09/01/09

Seguridad y precauciones  Este equipo es para uso diagnóstico in vitro solamente  Maneje el control positivo y negativo como potencialmente infecciosos, aún si han sido inactivados  Dado que ningún método de prueba puede ofrecer completa seguridad que los agentes infecciosos están ausentes, manejar los reactivos y muestras de pacientes como capaces de transmitir enfermedades infecciosas.  Usar guantes desechables y ropa de laboratorio. Seguir los procedimientos de laboratorios aceptados para trabajar con suero o plasma.  No pipetear con la boca

Desechar todas las muestras, cartuchos de reacción usados con el equipo, como material de desecho biopeligroso  No mezclar reactivos de diferentes lotes  No tocar las puntas de los goteros  No usar después de la fecha de caducidad Almacenamiento del equipo Almacenar el equipo de 2º a 8º C. No congelar. Manejo de muestras Pueden ensayarse muestras de suero o plasma. Las muestras pueden almacenarse por 7 días de 2º a 8º C, antes de probarse. Para conservarlas mas de 7 días congelar la muestra a -20ºC o temperatura más baja. Después de que las muestras han sido descongeladas, centrifugar para su clarificación. Probar el sobrenadante. Evitar el repetido congelamiento y descongelamiento. PROCEDIMIENTO Preparación de la prueba:  Leer cuidadosamente todas la instrucciones antes de comenzar la prueba  Llevar los reactivos, cartuchos de reacción y muestras a temperatura ambiente  Correr los controles positivo y negativo provisto con el kit cada día que realice la prueba, y o cuando un nuevo num. de lote se use.  Tomar el número requerido de cartuchos de reacción Genie II HIV-1/HIV-2 V2 de las bolsas de aluminio  Realizar la prueba a temperatura ambiente Instrucciones de la prueba 1. Unión de los anticuerpos específicos Agregar 3 gotas (150 µl) de reactivo # 1 al microtubo, (solución diluyente). Adicionar 50µl de muestra o control. Mezclar el contenido del tubo volviendo a llenar y dispensando repetidamente con el pipetor. Transferir inmediatamente el total del contenido del microtubo al compartimento A del cartucho de reacción. Descartar la punta de la pipeta y el microtubo como desperdicio biopeligroso. Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (aproximadamente 3 minutos).

Los siguientes pasos se realizan solamente en el compartimento B de reacción 2. 3. 4. Unión del conjugado Adicionar 3 gotas del reactivo # 2 (conjugado estreptavidina/AP) al compartimento B. Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (aproximadamente 3 minutos). Lavado Llenar el compartimiento B hasta arriba con reactivo #3 (solución de lavado). Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (aproximadamente 1 minuto) Reacción de color Adicionar 2 gotas de reactivo #4 (solución de sustrato cromógeno) al compartimiento B. Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (aproximadamente 3 minutos).

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5.

Reacción de paro Llenar el compartimiento B con reactivo #5 (solución de paro). Esperar hasta que la solución ha sido absorbida; entonces examinar el compartimiento B y anotar los resultados.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS  Validación  Examinar el soporte del compartimiento de reacción B. para confirmar el correcto funcionamiento de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, la mancha del control interno debe aparecer en cada cartucho.  La ausencia de la mancha del control interno debe ser considerado resultado inválido. La prueba debe repetirse.  Resultados  VIH-1 Positivo. La presencia del punto izquierdo VIH-1 junto con la del control interno, indica la presencia de anticuerpos contra VIH-1.  VIH-2 Positivo. La presencia del punto medio, VIH-2 junto con la de control interno indica la presencia de anticuerpos anti VIH-2.  VIH Positivo. La presencia de las 3 puntos, indican la presencia de anticuerpos anti VIH-1 y/o VIH-2. En este caso, la muestra debe probarse por métodos adicionales, los cuales permitan mayor diferenciación entre VIH-1 y VIH-2.  Resultado negativo. La presencia del punto de control interno solo indica la ausencia de anticuerpos VIH. ∗ Cualquier punto débil debe ser sospecha de reacción y debe continuarse su investigación. Limitaciones La prueba Genie II HIV-1/HIV-2 V2 es una prueba de escrutinio. Dado que la producción de anticuerpos contra VIH puede retrasarse después de la exposición inicial, las pruebas de escrutinio pueden fallar para detectar estadios tempranos de la infección de VIH. Si no hay reactividad con esta prueba, no debe considerarse evidencia concluyente de que el paciente no ha sido expuesto o infectado por VIH. La presencia de anticuerpos contra VIH-1 y/o VIH-2 en la muestra probada debe confirmarse por un ensayo confirmatorio.  Desempeño.  Sensibilidad. Se realizaron estudios de sensibilidad con un panel de 151 muestras positivas, que incluían 87 muestras VIH-1 positivas (con 11 del grupo O), 64 VIH-2 positivas y paneles de seroconversión. El producto Genie II HIV-1/HIV-2 V2 presentó un 100% de sensibilidad en positivos verdaderos y los paneles de seroconversión.  Especificidad.

La especificidad fue determinada en muestras provenientes de donadores de sangre (102 muestras estudiadas), en mujeres embarazadas (202 muestras) y en pacientes hospitalizados (270 muestras). La especificidad calculada fue de 99.8%, 100% y 100% respectivamente. Estudios adicionales de 53 muestras provenientes de personas con enfermedades que puedan interferir potencialmente con esta prueba (artritis reumatoide, enfermedades auntoinmunes o virales) no presentaron reacción cruzada.  Resumen del procedimiento de la prueba

Las instrucciones abreviadas que se presentan a continuación, son de usuarios con experiencia con el equipo Genie II HIV-1/HIV-2 V2 Llevar los reactivos, cartuchos de reacción y muestras a temperatura ambiente (22-26°C) y realizar la prueba Paso: 1. Unión de anticuerpos Reactivo 1:muestra Adicionar: 3 gotas (150 µl) 50 µl A: Microtubo Trasferir Tiempo: Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (-3 minutos)

al

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2. Unión del conjugado 3. Lavado 4. Reacción de color 5. Paro de reacción

2: 3: 4: 5:

Mezclar 3 gotas Llenar al (∼ 1ml) 2 gotas Llenar al (∼ 1ml) tope

compartimiento A Compartimiento B Compartimiento B Compartimiento B tope Compartimiento B

Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (- 3 minuto) Esperar hasta que la solución haya sido absorbida (- 1 minuto) Esperar hasta que la solución haya absorbida (- 3 minuto) Esperar hasta su absorción: Leer los resultados

RESULTADOS Se realizó la prueba a 4 sujetos del equipo y todos salieron negativos. Preparación de las muestras

Control Positivo (se observan 3 puntos) lo cual indica VIH-Positivo

Sujetos 1 y 2 (Braulio y Claudia): Negativos  Un solo punto (el último)

Sujetos 3 y 4 (Grisell y Diana): Negativos  Un solo punto (el último)

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS Al comenzar la prueba, la muestra diluida (en este caso plasma) es introducida en el compartimento A. Si están presentes anticuerpos anti VIH en la muestra, se unen específicamente a los antígenos VIH en un paso de reconocimiento dual, es decir, para HIV-1 y HIV-2. El complejo resultante reacciona con el conjugado estreptavidina/fosfatasa alcalina (AP) el cual diferencia la presencia de Antígenos al unirse el complejo formado anteriormente en caso positivo con el conjugado estreptovidina/fosfatasa alcalina donde el sustrato es la paranitrofenilfosfato; después se realizan los lavados para eliminar los anticuerpos que no son específicos para el antígeno y al ser absorbida la solución del cromógeno, la visualización de los resultados se observa como manchas gris azul es acompañada por la reacción de sustrato cromógeno; la solución de paro es adicional al final de la reacción para deternerla y de esta manera observar los resultados; de esta forma se pude decir que la prueba incorpora una combinación de inmunocromatografia e inmunoconcentración, lo cual es observado en los compartimientos del kit de la prueba. Las pruebas realizadas para los 4 sujetos de prueba se observaron con resultados negativos debido a que todos los individuos son sanos. Esto se observo en la prueba de Elisa Genie II HIV-1/HIV-2 V2 de la marca Bio-Rad al observarse que en el compartimiento B (elíptico) un solo punto en su extremo inferior (control interno) lo cual indica negatividad. CONCLUSIONES La técnica para el Genie II HIV-1/HIV-2 V2, el cual es un ensayo inmunoenzimatico (EIA) de reconocimiento dual esta basado en la detección especifica de anticuerpos anti VIH-1 y anti VIH-2 por anfígenos con inmunoreactividad mejorada que se unen a ambos sitios de unión de los anticuerpos( donde so inmovilizados) los cuales están igualmente situados en el compartimiento B y si hubiese presencia de estos en la muestra se hubiesen observado 2 puntos más (uno específico para cada tipo de antígeno), uno en medio y otro en el extremo superior del compartimiento B lo que indica la unión del conjugado a los antígenos específicos por visualización del cromógeno. La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da resultados confiables. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen más pruebas. Cuando sale positiva, es preciso practicar la IFA o la Western Blot , que son pruebas más específicas para confirmar los resultados. REFERENCIAS

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