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2.- Mitosis y Meiosis

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Diferenciar entre las células mitóticas y meioticas la división celular
Observar e interpretar figuras de distintas fases de la mitosis en las células vegetales de la cebolla
Por una parte se analizarán las diferentes fases de la espermiogénesis en preparaciones obtenidas mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1. Por otra, estudiaremos la organización de las células que cursan la espermatogénesis y el túbulo seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina.
Diferenciar entre las células mitóticas y meioticas la división celular
Observar e interpretar figuras de distintas fases de la mitosis en las células vegetales de la cebolla
Por una parte se analizarán las diferentes fases de la espermiogénesis en preparaciones obtenidas mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1. Por otra, estudiaremos la organización de las células que cursan la espermatogénesis y el túbulo seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina.

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PRÁCTICA # 2 “MITOSIS Y MEIOSIS”

OBJETIVOS    Diferenciar entre las células mitóticas y meioticas la división celular Observar e interpretar figuras de distintas fases de la mitosis en las células vegetales de la cebolla Por una parte se analizarán las diferentes fases de la espermiogénesis en preparaciones obtenidas mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1. Por otra, estudiaremos la organización de las células que cursan la espermatogénesis y el túbulo seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina.

INTRODUCCIÓN Existe un proceso celular destinado a producir células idénticas genéticamente: la MITOSIS. Por el contrario, la mayoría de los organismos vivos utilizan parte de su vida o tejidos especializados para producir células esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario. Este mecanismo celular está enclavado en un proceso especial de división celular: la meiosis. El proceso de reproducción celular conocido con el nombre de mitosis, puede ser estudiado eligiendo un material constituido por células que se hallen en continua división. Esta condición la reúnen los meristemos terminales o primarios, tales como los que se encuentran en el ápice de las raíces. Un bulbo de cebolla cuya base se mantenga en contacto con el agua durante 4 ó 5 días, nos proporciona abundante cantidad de raicillas jóvenes, muy apropiadas para la obtención de muestras destinadas a observar.1 En organismos superiores la meiosis tiene lugar en los órganos sexuales tanto masculinos como femeninos, dentro de un proceso general que se denomina respectivamente espermatogénesis y ovogénesis. Tanto uno como otro no sólo producen células diferentes genéticamente, sino que reducen el número de cromosomas de las células a la mitad y las modifica para poder ser fecundadas o fecundar dependiendo del sexo en donde se realice. Ciclo celular: Mitosis Todos los seres vivos, uni- y pluricelulares tienen como misión fundamental la de reproducirse preservando sus características esenciales a través de las generaciones. Los fenómenos que tienen lugar durante la reproducción celular corresponden a una de las etapas del proceso conocido como ciclo celular. Este ciclo resulta de la coordinación de una serie de procesos que involucran la integración de diferentes señales que conducen a la duplicación de DNA, su condensación, segregación y posterior descondensación. Dentro de este ciclo, la mitosis es la etapa durante la cual una célula da origen a dos células hijas con igual dotación de cromosomas. Aunque la mitosis, de por sí es un proceso continuo, para su estudio se divide en diferentes etapas consecutivas de acuerdo a los cambios morfológicos que va experimentando la célula y que se continúan con la citocinesis. 2 El ciclo celular es el período comprendido entre la formación de una célula, por división de otra precedente, y el momento en que ella misma se divide para originar dos células hijas. El ciclo celular se puede dividir en dos grandes períodos: interfase y mitosis, cada uno de los cuales se subdivide en varias fases o etapas. La interfase se encuentra subdividida en 3 etapas: a) Período G1. Comienza la síntesis de RNA y proteínas, la cual perdura durante toda la interfase. b) Período S donde ocurre la duplicación del ADN. c) Período G2, fase postsintética que va desde el final de S hasta el comienzo de la mitosis. Por otro lado, en la mitosis ocurren 2 procesos altamente sincronizados: la cariocinesis (división del núcleo) y la citocinesis (división del citoplasma). En la cariocinesis se reconocen distintas fases: profase, metafase, anafase y telofase. Algunos autores reconocen a la prometafase como un estadio entre profase y metafase. La mitosis finaliza con la citocinesis, la cual es diferente en animales y vegetales. Para estudiar los parámetros del Ciclo Celular se utilizan tejidos en constante renovación (tejidos en proliferación), en los que la duración total del ciclo con determinadas condiciones es constante. Cuando las células de un meristemo de Allium cepa se encuentran en equilibrio proliferativo, la duración de cada uno de los períodos del ciclo celular permanece constante. De esta forma, el número de células que están en

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una fase determinada es también constante y proporcional a la duración (en tiempo) de la misma. Teniendo en cuenta esto se puede calcular la duración relativa de las diferentes fases del ciclo, es decir de la interfase y de la mitosis, así como de cada una de las etapas de ésta. Fases de la mitosis (a) INTERFASE: Núcleos en interfase. La cromatina aparece bastante homogénea, a excepción de zonas más claras que corresponden a los nucleolos. (b) PROFASE: La cromatina comienza a condensarse. A medida que avanza este estadio desaparece el nucleolo. Los “cromosomas” aparecen como filamentos delgados. (d) METAFASE: Cada cromosoma, integrado por dos cromátidas hermanas, se dispone con su centrómero en el plano ecuatorial. (e-f) ANAFASE: Las cromátidas hermanas se separan y comienzan a migrar hacia los polos opuestos de la célula. Ahora los cromosomas se observan formados por una sola cromátida, con los centrómeros dispuestos hacia los polos y los telómeros hacia el centro de la célula. (g) TELOFASE: No es posible individualizar los cromosomas. La cromatina comienza a descondensarse en ambos núcleos hijos. 3 Espermatogénesis Ham, en 1677, observa por primera vez en el semen humano la presencia de unos "animáculos" móviles que muchos científicos de la época consideraron como parásitos o simbiontes. En 1780 Spallanzani comprueba que si del semen eran eliminados estos cuerpos móviles, éste perdía su capacidad fertilizante. Pero fue en la segunda mitad del siglo pasado cuando se concluyó que estos "animáculos" eran los gametos masculinos, y se les denominó espermatozoides. De esta forma se estableció que los espermatozoides se originaban en los testículos y que poseían núcleo y citoplasma: eran células. Desde este momento y hasta nuestros días la morfología de los espermatozoides y de las células que les dan origen han sido ampliamente estudiadas. En una primera etapa de la citología, empleando cortes en parafina, no sólo se describen gran cantidad de formas distintas de espermatozoides, sino que también se pone gran interés en el estudio de los epitelios en los que se originan. Posteriormente, con el avance de la técnica y la aparición del microscopio electrónico, se determina la ultraestructura de los espermatozoides y de las células intermedias en su formación. En la figura se observa la reconstrucción fotográfica de una sección de un túbulo seminífero de saltamontes en el que se observa la disposición secuencial de las células que cursan la espermatogénesis. La introducción de nuevas técnicas de estudio como pueden ser las citoquímicas para microscopía óptica y electrónica, la aplicación de microscopía de barrido, el empleo de anticuerpos marcados a nivel morfológico y ultraestructural o metodologías puramente bioquímicas han ayudado a un mejor conocimiento del proceso de formación de los gametos masculinos, la espermatogénesis. Desde antiguo recibió gran atención el proceso de cómo se formaban estas células, ya que a partir de una célula prácticamente indiferenciada, la espermatogonia, se produce una complicada y a veces dramática serie de cambios morfo-funcionales que desembocan en la formación del espermatozoide: la espermatogénesis. Podríamos definir a la espermatogénesis como el conjunto de cambios que ocurren en una célula prácticamente indiferenciada, espermatogonia, y que tienen como final la formación de una célula altamente especializada, con un número haploide de cromosomas recombinados y capaces de fecundar: el espermatozoide. Teniendo en cuenta los cambios que se producen en la espermatogonia, y por tanto los nuevos tipos celulares y los procesos en los que participan, podemos dividir a la espermatogénesis como proceso en las siguientes etapas:

a)

Proliferación. Este período comprende el desarrollo de las espermatogonias, las cuales se dividen no sólo aumentando la población celular sino manteniendo la población troncal existente. Las divisiones de población espermatogonial llegan en algunas especies hasta ocho. Así, partiendo de una espermatogonia inicial, van surgiendo por divisiones sucesivas grupos de ellas, que normalmente se encuentran interconectadas por sus citoplasmas. El número final de gonias presentes en un cisto, en las especie que lo posean, indicará por lo tanto las veces que se han dividido a partir de la espermatogonia primordial. De esta forma un cisto con

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doscientas cincuenta y seis gonias revela la existencia previa de ocho divisiones mitóticas. En esta fase de divisiones rápidas y continuas es fácil observar el cariotipo de la especie. b) Crecimiento y meiosis. La meiosis se caracteriza por presentar dos divisiones sucesivas del material hereditario (División I y División II) precedidas por un único período S (de síntesis de ADN). La profase de la primera división meiótica es extremadamente larga pudiendo durar desde días (en machos) hasta años (generalmente en hembras). Para su estudio, se ha dividido en base a la morfología del núcleo celular en varias etapas: leptotene, cigotene, paquitene, diplotene y diacinesis.
PRIMERA DIVISIÓN MEIÓTICA PROFASE I: LEPTOTENE CIGOTENE PAQUITENE DIPLOTENE DIACINESIS PROMETAFASE I METAFASE I ANAFASE I TELOFASE I INTERCINESIS SEGUNDA DIVISIÓN MEIÓTICA PROFASE II PROMETAFASE II METAFASE II ANAFASE II TELOFASE II

En la primera anafase meiótica los cromosomas homólogos, que previamente han recombinado, migran completos a polos opuestos. Tras una interfase muy corta, y a veces inexistente denominada intercinesis, se efectúa la segunda división meiótica. Ésta es esencialmente igual que una división mitótica convencional con la excepción de que cada célula solamente posee un complemento cromosómico de la especie y ya recombinado. El resultado final es la formación, por cada una de las células que entró en la profase I, de cuatro células haploides y con una carga "c" de ADN: las espermátidas.

Espermatogénesis de Locusta migratoria en cortes de testículo teñidos con tricrómico de Masson (I). A.- Detalle de un túbulo seminífero en el que se aprecia la estructura celular en cistos. B.- Espermatogonia. El cromosoma sexual aparece marcado (X). C.- Espermatocito en división (telofase I) en el que se observa el huso de microtúbulos (cabeza de flecha).

c)

Espermiogénesis. Se conoce con este nombre a toda la serie de cambios tanto citoplásmicos como nucleares que sufren las espermátidas hasta convertirse en espermatozoides. Estos cambios son muy variables y dependen de la especie estudiada. No obstante, y como rasgos generales, podemos decir que se centran en la compactación de la cromatina en el núcleo, la pérdida de casi la totalidad del citoplasma y la adquisición de un aparato locomotor por parte de la célula.

Espermatogénesis de Locusta migratoria en cortes de testículo teñidos con tricrómico de Masson (II). Espermátidas en distintos estados de maduración. Obsérvese la paulatina condensación de la cromatina y modificación del núcleo y los adjuntos centriolares (cabezas de flecha). A.- Espermátidas tempranas, en las que aún no se ha estructurado el adjunto centriolar. La que se encuentra a la derecha es diploide, aberrante. B.Espermátida aberrante, poliploide, con dos adjuntos centriolares. C y D.- Con esta técnica de tinción se aprecian los flagelos (flecha). Espermatóforos de Locusta migratoria en aplastado teñido con Feulgen. A.Campo claro, donde sólo se aprecian los núcleos. B.- Contraste de fase, que permite ver los flagelos de las espermátidas (cabezas de flecha). REACTIVO DE SCHIFF En química, el reactivo de Schiff (inventado y nombrado por Hugo Schiff) es un reactivo para la detección de aldehídos. FORMULA DEL REACTIVO DE SCHIFF, USADO PARA RECONOCER ALDEHIDOS:

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1. Pesar 100 miligramos de fucsina. 2. disolver en 75 ml. de agua destilada, a 80 grados centígrados. 3. enfriar. 4. agregar 2.5 gramos de bisulfito de sodio, disolver. 5. agregar 1.5 ml. de acido clorhídrico concentrado, agitar. 6. aforar a 100 ml. con agua. 7. NO usar después de 14 días de preparado. Fucsina: Formula: C20-H20-Cl-N3. Sinónimos: violeta básica, Magenta I, alfa4-(p-aminofenil)-alfa4(imino-2,5-clorhidrato. EL ACIDO LEUCOSULFONICO ES EL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL DEL PROCEDIMIENO PARA FORMAR EL REACTIVO !NO SON EL REACTIVO INICIAL! AL FINAL NO TENEMOS FUCSINA, ES UN ACIDO INESTABLE, EL LEUCOSULFONICO. Tanto si se usa bisulfito de sodio, como gas SO2, el bisulfito de sodio se descompone dando SO2 gaseoso, por lo cual en ambos métodos, SOLO SE PRODUCE ACIDO LEUCOSULFONICO, incoloro, y que cambia a color violeta púrpura con un aldehído, al perder acido sulfuroso, por la reacción, pues este es un acido inestable MATERIAL  Microscopio  Porta y cubre-objetos  Vidrio de reloj  Tiras de papel de filtro  Pinzas de disección  Vaso de precipitados  un bulbo de cebolla  Pinzas finas  Lanceta estéril  Cubeta de tinción  Caja de petri


 Tijeras REACTIVOS

Mechero de alcohol

Piceta

Orceína A y B  Agua enmangada  Reactivo de Schiff PROCEDIMIENTO A) MITOSIS EN CEBOLLA Preparación de la cebolla

 Agua sulfurosa  HCl  Ácido acético

1. llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud. 2. cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A. 3. Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición, hasta la emisión de vapores tenues. 4. con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto. 5. colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unos golpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida. 6. sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. poner el dedo pulgar sobre el papel filtro en la zona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale. Si la preparación está bien asentada no hay peligro de rotura por mucha presión que se realice. 7. observar al microscopio. Observación microscópica 1. Se realizará a fuertes aumentos. La Orceína A reblandece las membranas celulares y la B completa el proceso de tinción. Con la presión sobre el porta de la preparación se logra una extensión y difusión de las células del meristemo de la cebolla. 2. la preparación presenta el aspecto de una dispersión de células por todo el campo que abarca el microscopio. Se observan células en diversas fases o estados de división celular. Se ven los cromosomas teñidos de morado por la Orceína. El aspecto reticulado así como el mayor tamaño de algunos núcleos corresponden a las células que se encontraban en los procesos iniciales de la división mitótica. B) MEIOSIS EN ORTÓPTERO 1.- Aplastados de testículo de ortóptero teñidos con Feulgen

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Seleccionamos testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético 3:1 al menos una semana antes y lo colocamos en agua destilada para su hidratación durante 10 minutos. A partir de este momento realizar todo el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún elemento metálico.  Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan abundantemente en agua destilada. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad. Se lavan los testículos, que tendrán un color violeta, en agua sulfurosa y posteriormente en agua del grifo, donde se almacenarán hasta la confección de los aplastados.  Separamos un par de túbulos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos. ¡Cuidado, no dejar secar el material!  Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave se dispersa el material.  Con un trozo de papel de filtro se elimina el acético que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realiza el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie plana.  Observar los aplastados en el microscopio tratando de determinar las diferentes etapas del proceso meiótico, así como las espermátidas en los diferentes estadíos de la espermiogénesis. 2.- Secciones de testículo de ortóptero teñido con tricrómico de Masson El análisis de cortes de parafina supone la realización de tres procesos: la inclusión del material en un medio sólido, el corte y desparafinado del mismo y la tinción de los cortes (Apéndice). Las secciones de testículo se observarán en el microscopio determinando la disposición de los túbulos seminíferos en el conjunto, así como las zonas apicales y basales de los túbulos. Células del testículo del saltamontes Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. A.- Núcleo de una espermatogonia en interfase. El cromosoma sexual ha sido señalado con una X. B.- Metafase espermatogonial. C.- Núcleo prepaquiténico. Posiblemente corresponde a un núcleo en leptotene. D.- Paquitene medio. E.- Paquitene tardío. F.- Diplotene. Se ha señalado la posición de los quiasmas en un bivalente monoquiasmático (M7), en uno con dos quiasmas (M4) y en un tercero que presenta cuatro (L1).

Espermatocitos de Chorthippus jucundus teñidos con orceína lacto- propiónica. A.Diplotene tardío-diacinesis. B.Metafase-I. C.- Anafase- I. El cromosoma sexual X migra completo al polo superior de la célula. D.- Telofase- I. E.Intercinesis/Profase-II. La célula de la parte superior de la fotografía posee el cromosoma X, mientras que la de la parte inferior carece de él. Células del testículo de Chorthippus jucundus teñidas con orceína lactopropiónica. A.- Metafase- II. Se observa la disposición radial de los cromosomas. B.- Anafase- II. Las cromátidas están comenzando a separarse. C.- Anafase- II. D.- Telofase-II. E.- Espermátidas tempranas. La situada en la parte superior de la fotografía posee el cromosoma sexual (X), mientras que la de la parte inferior carece de él. F,G,H- Espermátidas en diferentes estados de maduración.4

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RESULTADOS A) MITOSIS EN CEBOLLA Durante la práctica, donde estudiamos células en proceso de mitosis en la raíz de la cebolla encontramos todas las fases de replicación anafase, telofase, metafase, profase y diacinesis logrando ver las diferentes formas en la que el núcleo y sus cromosomas se ven en este tipo de proceso celular.

FASE Núcleo interfásic o

OBSERVACIONES Se observa el núcleo en interfase; La cromatina aparece bastante homogénea, a excepción de zonas más claras que corresponden a los nucleolos.

IMAGEN

Profase:

La cromatina comienza a condensarse. A medida que avanza este estadio desaparece el nucleolo. Los “cromosomas” aparecen como filamentos delgados. En la imagen esto no se observa muy bien pero al microscopio si.

Metafase

Cada cromosoma, integrado por dos cromátidas hermanas, se dispone con su centrómero en el plano ecuatorial.

Anafase

Las cromátidas hermanas se separan y comienzan a migrar hacia los polos opuestos de la célula. Ahora los cromosomas se observan formados por una sola cromátida, con los centrómeros dispuestos hacia los polos y los telómeros hacia el centro de la célula

Telofase

La cromatina comienza a descondensarse en ambos núcleos hijos ya que no es posible individualizar los cromosomas; esto se observa como 2 núcleos dentro de una misma célula.

Diacinesi s

Se observa como un núcleo dividiéndose en dos partes; es decir: la división del citoplasma.

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B) MEIOSIS EN ORTÓPTERO

Citógenos:

Túbulo seminífero:

Espermatóforo: DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

 

Se realizaron 2 prácticas: una para observar la mitosis (con los meristemos de la cebolla) y otra para la observación de la meiosis (en las gónadas de un ortóptero: grillo).

En la mitosis, se llegaban a distinguir un poco los cromosomas tras el proceso de tinción que llevaron a cabo, posteriormente fijando con bálsamo de Canadá el portaobjetos debido a que se observaban claramente todas las fases de la mitosis.  Como se describió en los resultados y ya que se pusieron las observaciones e imágenes en orden del ciclo celular se puede observar como estas células se encontraban en continua división para su replicación o división celular, cuya finalidad como se observó en las imágenes es el dar origen a dos células hijas con igual dotación de cromosomas.

Durante el otro proceso de meiosis el cual solo lo efectúan las células de reproducción, óvulos y espermatozoides no fue posible observar las estructuras de interés indicadas para la práctica (células en reproducción) debido a que el grillo que se utilizó para el estudio fue demasiado joven e inmaduro sexualmente para poder lograr tener buenas imágenes del proceso de meiosis, por lo cual tan solo se observaron algunos citógenos, el tubo seminífero en el que se observa la disposición secuencial de las células que cursan la espermatogénesis y por último los espermatóforos. Se empleó la tinción de Feulgen para evidenciar núcleos celulares, ya que tiñe DNA al hidrolizar el anillo furazónico del DNA.

CONCLUSIÓN Durante esta práctica, se estudió e identificaron los principales cambios morfológicos que se presentan durante la profase, metafase, anafase, telofase y citocinesis en células meristématicas de raíces de cebolla Allium cepa (cebolla), por su simplicidad de manejo y el gran tamaño de sus células. La preparación presentó el aspecto de una dispersión de células por todo el campo que abarca el microscopio. Se observaron células en distintas fases o estados de división celular. Con esta técnica de tinción se ven los cromosomas impregnados por la orceína en color morado rojizo. También se debieron haber observo las fases de la división mitótica, sin embargo debido a que el grillo utilizado era muy pequeño reproductivamente, no se lograron observar estas divisiones celulares, solo algunos de los componentes de sus células sexuales, pero esta parte de la práctica se podrá estudiar con la teoría de la introducción, en donde viene descritas estas fases con ayuda auxiliar de las imágenes que describen a cada una de estas fases. REFERENCIAS

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http://www.arrakis.es/~rfluengo/mitosiscebolla.html http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20No%209.%20MITOSIS.pdf 3 http://genetica.fcien.edu.uy/materiales/PRACTICOS/mitosis/mitosis.pdf 4 http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm

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