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7. Extraccion de DNA Con DNAzol

7. Extraccion de DNA Con DNAzol

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Extraer DNA de diversos materiales biológicos
Analizar los resultados de la extracción por electroforesis en gel de azarosa
Comparar los resultados obtenidos en el gel respecto al tamaño del genoma, dependiendo de la especie de la cual se extrajo.
Extraer DNA de diversos materiales biológicos
Analizar los resultados de la extracción por electroforesis en gel de azarosa
Comparar los resultados obtenidos en el gel respecto al tamaño del genoma, dependiendo de la especie de la cual se extrajo.

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PRÁCTICAS 7 “EXTRACCION Y PURIFICACION DNA CON DNAZOL”

OBJETIVOS

  

Extraer DNA de diversos materiales biológicos Analizar los resultados de la extracción por electroforesis en gel de azarosa Comparar los resultados obtenidos en el gel respecto al tamaño del genoma, dependiendo de la especie de la cual se extrajo.

INTRODUCCIÓN
LOS ACIDOS NUCLEICOS. Es muy probable que, en la actualidad, todo mundo haya escuchado hablar de los ácidos nucleicos, en particular del ADN, simplemente por los descubrimientos recientes y por las grandes innovaciones tecnológicas en la investigación del ADN, los cuales no dejan de aparecer casi a diario en los grandes periódicos. Las iniciales ADN significan ácido desoxirribonucleico. Se encuentra en todas las células. Al ADN muchas veces se le llama la molécula central de la vida, ya que contienen las unidades de la herencia, que se llaman genes son un código químico que especifica el tipo de proteína que un organismo puede producir y estas proteínas incluyen a las enzimas que regulan la mayor parte de la actividad celular. ESTRUCTURA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS. Cada molécula de ADN está formada por dos polímeros extremadamente largos sostenidos entre sí por enlaces de hidrógeno y enrollados en lo que se conoce como doble hélice. Cada uno de los dos polímeros está formado por numerosas subunidades llamadas nucleótidos, enlazadas covalentemente formando las cadenas. Cada nucleótido está compuesto por tres partes: un compuesto de fósforo llamado fosfato, un azúcar de 5 carbonos simples y una base nitrogenada. Existen cuatro bases nitrogenadas en el ADN, por lo tanto hay cuatro diferentes nucleótidos. Su ordenamiento lineal específico dentro del polímero constituye el código químico (código genético). En otras palabras, los genes son básicamente un ordenamiento de nucleótidos. En nuestro ADN que simplemente determina como serán nuestras proteínas. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DEL DNA El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación. El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas. La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme sale de la solución. En la interfase el RNA sale de la solución salina. En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados que se asienta en el fondo del vaso. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA. SEPARACIÓN DEL DNA MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL. La electroforesis en gel se utiliza más ampliamente en la separación de ácidos nucleicos de diferente peso molecular.

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Las moléculas RNA o DNA pequeñas, de unos pocos cientos de nucleótidos o menos, por lo general se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamina. Las moléculas de mayor tamaño tienen problemas para desplazarse a través de la cerrada trama de la poliacrilamina y en general se fraccionan en gel de agarosa que tiene mayor porosidad. La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas. El gel con agarosa en baja concentración (0.34) se emplea para separar fragmentos de DNA de mayor tamaño. MATERIAL


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Tubos Eppendorf Micropipeta de 10 a 100 Micropipeta de 100 a 1000 Gradillas para eppendorf Puntas para Micropipetas Guantes

MUESTRAS BIOLOGICAS


Cepa de Aspergillus niger Cabello humano

REACTIVOS       EQUIPO  Centrífuga  Cámara para corrimiento de electroforesis  Voltímetro  Cámara de UV PROCEDIMIENTO Extracción de DNA con el reactivo DNAzol. 1. 2. 3. 4. 5. Para bacterias, inocular una colonia de E.coli en 10 ml de LB, crecer hasta fase log tardía u overnight en baño con agitación 37 C, 180 a 200 r.p.m. Para sangre centrifugada 2500 r.p.m. durante 10 minutos, separar los leucocitos y lavarlos con PBS por centrifugación. Para plantas y cualquier otro tejido, macerar el tejido y pasar al paso 5. Se tomo una asada de la cepa del hongo Aspergillus Níger (este fue nuestro caso, ya no se realizo de sangre ni de bacteria) Centrifugar por 10 min a 3000 r.p.m. descartar sobrenadante con pipeta para romper el pellet. Agregar 250 μl de DNAzol. Homogenizar bien con la pipeta para romper el pellet. Centrifugar 10 minutos a 5000 r.p.m. Trasvasar el sobrenadante a otro tubo sin tocar el pelet. Agregar 250 μl de isopropanol 100%. Mezclar con la pipeta. DNAzol para células humanas y para microorganismos Isopropanol Agua DEPC Buffer Colorantes: Azul de Bromofenol y xilencianol Azarosa (agar)

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9. 10. Centrifugar a máxima durante 1 minuto. Previamente puede dejarse en frío -20 C. 11. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 250 μl de isopropanol al 70%.
12. Centrifugar a máxima por 5 minutos. 13. Dejar secar el pellet al aire. 14. Resuspender en agua DEPC. Agitar suavemente. 15. Incubar O.N. a 37 C 16. Medir concentración de DNA extraído.

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Cuantificación de DNA El DNA se cuantifica por valoración electroforética, comparándolo con concentraciones conocidas de DNA de fago lambda, y por espectrofotometría UV, empleando la relación de lectura de OD 260/280 (18). Se calcula la concentración del DNA con base a que la concentración del DNA de 50 µg/ml equivale a una DO de 1 a 260 nm (concentración del DNA = [DO260] x [factor de dilución] x [50 µg DNA/1 DO]). La relación de 260/280, se considera como medida de la pureza del DNA y debe permanecer entre 1.6 y 1.9. Visualización del DNA con electroforesis con geles de agarosa. Electroforesis en azarosa para muestras de DNA La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. La electroforesis en azarosa permite separar moléculas de DNA, cuando estas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae el DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula. Preparación de gel de azarosa. 1. Determinar la concentración y el volumen de gel que se necesita. Si el DNA tiene un tamaño desconocido se debe usar gel de agarosa al 1.0%. 2. Preparar el gel al porciento deseado según se indica el siguiente ejemplo. Preparar 30 ml de azarosa al 1.0% (1g/100ml) (30ml)(1g/100ml) = (Xg) El resultado es 0.3g 3. Pesar la cantidad de agarosa que se necesite y transferir a un matraz Erlenmeyer. 4. Añadir el volumen deseado de solución amoirtiguadora Tris Borato EDTA (TBE) 0.5 X. 5. Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente. 6. Enfriar la agarosa hasta 50 C. 7. Colocar el peine (comb) en la cámara de electroforesis. 8. Verter la solución de agarosa evitando la formación de burbujas, estas pueden ser removidas con la punta de un micropipeta. 9. Dejar que solidifique a temperatura ambiente y en una superficie nivelada para obtener un espesor uniforme del gel. Para cargar el gel de agarosa. 1. Colocar la agarosa dentro de la cámara de electroforesis. 2. Añadir suficiente TBE 0.5 X hasta cubrir completamente el gel (aprox. 0.5cm sobre el gel) 3. Cargar cuidadosamente 10  de muestra por pozo utilizando una micropipeta. Incluir un marcador de l peso molecular. 4. Conectar el equipo de electroforesis. 5. Prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (100V) y las muestras deberán correr hacia el electrodo positivo. 6. correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido. 7. Apagar el equipo. Visualizar el DNA en el gel con azul de metileno. 1. Colocar el gel en una solución de 0.025% azul de metileno por 15 minutos. Debe quedar totalmente sumergido. 2. Desteñir el gel den agua destilada por 15 minutos. Debe sumergirse de nuevo. 3. El DNA se torna visible cuando se observa en una lámpara de luz visible. 4. Fotografiar el gel Visualización del DNA con bromuro de etidio 1. De manera alternativa, al preparar la agarosa se le puede gregar bromuro de etidio (0.1mg/ml) al 10%. 2. Se visualiza el gel con una lámpara de luz UV. 3. fotografiar la gelatina usando una cámara. 4. fotografiar el gel usando una cámara digital o de celular.

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RESULTADOS Tubos eppendorf con la muestra del hongo y el cabello

Colocación de las muestras en el Agar

Corrimiento del DNA en el Agar, se observa la coloración apartir de una Cámara de UV

DISCUSIÓN DE RESULTADOS Para poder extraer el ADN de algún organismo, se necesita una muestra biológica, la cual en nuestro caso fue el cabello, pero también pudo haber sido sangre periférica, saliva, etc. Otra muestra utilizada es la cepa del hongo Aspergillus níger la cual nos sirve para comparar resultados, se realizo el procedimiento de electroforesis para la extracción del ADN, en la cual se separa las moléculas pequeñas de las moléculas grandes, sabiendo que el ADN es una molécula con carga negativa, se va a separar al desplazarse hacia donde se encuentra la carga negativa, separándose de las demás moléculas. El proceso consta de varios lavados con diferentes disolventes, como lo

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fueron: el Isopropanol, agua DEPC (Dietilpirocarbonato), y el colorante que nos indica el corrimiento de la separacion del ADN, y el principal que fue DNAzol, el cual es el principal para extraer el ADN de la muestra. CONCLUSIONES Se extrajo el ADN para poder observar su presencia y corrimiento por medio de la técnica de electroforesis en agarosa la cual permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula. En teoría dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica, el parámetro que rige el avance (aceleración = fuerza/masa) de la electroforesis es realmente la relación carga/masa. Para un ácido nucleico, la carga eléctrica es proporcional a la longitud en nucleótidos, por lo que la relación q/m es la misma para todas las moléculas. Sin embargo, el efecto de retardo debido al gel depende del tamaño molecular. Como resultado neto, la electroforesis separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en nucleótidos (si son de hebra sencilla) o en pares de bases (si son de doble hebra, caso común del DNA). Es, por ello, posible establecer una curva de calibrado que relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta se suele representar tamaño frente a 1/movilidad o log(tamaño) frente a movilidad, sin embargo esto solo se realizó cualitativamente ya que no se cuantificó la movilidad del ADN a través de la placa de agarosa, solo se observó cualitativamente al observar la coloración del medio. REFERENCIAS ∼ A simple salting out procedure for extracting DNA from human cell. S. A. Miller, D. D. Dykes and H. F. Polesky. 1988. *Nucleid Acids Research: 16 (3): 1215. Biología Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders., 1a edición. Editorial Trillas. México 1991: página 97, 98. www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-QPCR-protocolos.pdf biowww.net/international/detailspanish-286.html

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