Extracción de Muestras Pecuarias

Los microorganismos agentes de deterioro de

productos pecuarios

LABORATORIO: Enterobacteriaceas

Prof. Miriam Troncoso

Asignatura: ALR3141 -
25/05/2022
 REPASO MATEMATICO

10 = 101 Multiplicación potencia 6.000 = 6 x 103

100 = 102 10 x 102 = 103 60 x 102
1.000 = 103 102 x 103 = 105 600 x 10
10.000 = 104
100.000 = 105 4.000 = 4 x 103 6.400 = 6,4 x 103
1.000.000 = 106 40 x 102 64 x 102
400 x 10 640 x 10
Microorganismos indicadores
 Un microorganismo o grupo de microorganismos,
cuya presencia en un alimento o en el ambiente a un
nivel determinado, es indicativo de un problema
potencial de calidad, higiene e inocuidad,
demostrando una falla en el proceso.

- detectable con facilidad y rapidez

- recuentos se deben correlacionar con los del patógeno
de interés.
Objetivo de la clase….
 Conocer la técnica de Recuento de Enterobacteriaceas
aplicada en alimentos

 Conocer medio de cultivo y calcular cantidad que debo

preparar para realizar el procedimiento.
 Recuento de Enterobacteriaceas
 Históricamente uno los Indicadores de Higiene más utilizados.

 Algunos miembros de la familia se asocian con materiales vegetales, mientras

que otros se encuentran de una forma más exclusiva en los tractos intestinales
de humanos y animales.
Las Enterobacteriaceae pueden contaminar los alimentos crudos y procesados
por medio de la tierra, polvo, agua, insectos, heces animales y humanas, así
como también los equipos.

 Actualmente, es aplicado para algunos alimentos en reemplazo de los

organismos coliformes.

Ventaja radica principalmente en que el análisis para coliformes no detecta

cepas de Escherichia coli lactosa negativa y la posible presencia de otros
microorganismos patógenos lactosa negativa como Salmonella y Shigella.
Enterobacterias
E. coli

Coliformes fecales

Coliformes totales

Enterobacterias
Enterobacteriaceas:
 Los miembros de la familia Enterobacteriaceae y coliformes están ampliamente
distribuido en el ambiente (ubicuos)
 Frecuentes en productos agrícolas, frutos secos, y granos, vegetales, carnes en
general, etc.
 No necesariamente de origen fecal
 USA, ha continuado utilizando los coliformes como un indicador de higiene,
mientras que Europa ha empezado a emplear toda la familia Enterobacteriaceae
para este propósito.

 No deberían estar presentes en alimentos altamente procesados o en superficies

higienizadas correctamente.

 Su presencia en superficies se relaciona con problemas de higiene y cuando están en

alimentos altamente procesados, indican una contaminación post-proceso.

 Involucrados en la degradación de los alimentos (vida útil)

Recuento Enterobacteriaceae
Los resultados de este análisis permitirían:

 Detectar contaminación posterior al

tratamiento térmico

 Evaluar efectividad del proceso

 Recontaminación

 Cloración del agua

Enterobacterias
• Bacilos Gram negativos
• Microflora del intestino (coliformes) tierra y agua
• Sensibles a desinfectantes comunes (cloro)
• Algunos tienen flagelos
• Fáciles de cultivar
• Anaerobios facultativos o aerobios
• Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la
producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia
gama de substratos en condiciones aeróbicas.
• Capaces de reducir Nitrato a Nitrito
ENTEROBACTERIAS
- Enterobacterias patógenas: Escherichia coli enteropatógeno, Shigella, Salmonella, Yersinia
- Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Hafnia,
Edwardsiella, Providencia, Morganella

Especies más frecuentes con significancia clínica

Citrobacter freundii, Citrobacter koseri
 Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae
 Escherichia coli
 Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca
 Morganella morganii
 Proteus mirabilis, Proteus vulgaris
 Salmonella enterica
 Serratia marcescens
 Shigella sonnei, Shigella flexneri
 Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis
Recuento de Enterobacteriaceas

 Se utiliza para determinar el número de MO por gr o mL de la

muestra.

 Hay que usar diluciones decimales

 Emplea técnica de recuento en placa con siembra en

profundidad o vertido en placa + una segunda capa de agar
(cobertura).
Detección de Enterobacteriaceas en alimentos

 Aislamiento selectivo.
• Utiliza un medio selectivo diferencial que
permite el desarrollo de diferentes especies Recuento directo
de Enterobacteriaceas: Agar VRBG en placa

ISO 21528
 Identificación bioquímica.
• Se confirma a Enterobacteriaceas en base a
pruebas bioquímicas:
 oxidasa y fermentación de la glucosa.
Diagrama de flujo para Enterobactericeas
1. Preparación de la muestra

2.Homogenización de la muestra

3. Diluciones seriadas

4. Siembra en Agar VRBG

Incubación 24 hrs-37°C
10-1 10-2 10-3 10-4
5. Recuento presuntivo
Pruebas confirmativas

5. Recuento final
Materiales:
 Agar VRBG
 Matraces o Botellas (shott)
 Mechero Bunsen Mat. Preparación muestras
 Balanza
 Agitador magnético* +  Homogenizador
 Pinzas
 Baño termoregulado*  Bolsa estéril

 Pipeta/puntas o pipeta/propipeta
 Placas Petri estériles vacías
 Lápiz marcador
 Incubadora (estufa de cultivo)*
 Autoclave *Son prescindibles
PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS

ESTERILIDAD!!!

Sanitizar adecuadamente el área de

trabajo !!!
1 . PREPARACION DE LA MUESTRA
a) Higienizar envase primario de muestra:

✔ Con una pinza estéril, tomar gasa estéril y dispersar alcohol

70º sobre la superficie.

✔ Dejar actuar y volatilizar antes de abrir el envase

Normalmente, una muestra se puede descongelar a 2-5°C en 18 h.

Para una descongelación rápida, descongelar la muestra a menos de
45°C durante no más de 15 min.
1. HOMOGENIZACION DE LA MUESTRA

Pesada de la muestra
• En condiciones asépticas, en las
proximidades del mechero, con
material estéril:

• Pesar 25 g de muestra en bolsa

estéril
• Medir 25 ml de muestra
ESTERILIDAD!!!
*Muestra representativa de la
totalidad de la muestra
 2. HOMOGENIZACION DE LA MUESTRA

Dilución -1

+
25 gr carne 225 mL agua
peptonada 0,1%
DILUYENTE

+ Homogenización.
1 a 3 min.

25 mL leche 225 mL agua

peptonada 0,1%
DILUYENTE
3. Diluciones seriadas.
4. Siembra.

Verter 15-20 ml agar

VRBG 45-50°C

Siembra placas de agar VRBG
mediante incorporación
Dejar solidificar y
luego verter en la
superficie 5 ml agar
VRBG 45-50°C .
Solidificar e incubar
en posición invertida
a 37°C – 24 ± 2 horas
Placa invertida

4. Incubación
24 ± 2 horas, 37°C.
Enterobacteriaceas en agar VRBG
Las colonias típicas de Enterobacteriaceas
son redondas, de color rojo a púrpura que
pueden estar rodeadas por un halo
precipitación de color purpura.

 El Agar VRBG contiene cristal violeta y

sales biliares como inhibidores de
organismos Gram positivos.

 La degradación de la glucosa a ácido se

muestra por el color rojo del indicador
de pH, rojo neutro.

Colonias rojas= Colonias glucosa +

Recuento Presuntivo de Enterobacteriaceas:
Finalizada la incubación a 37°C por 24 ± 2
horas. 10-1 10-2 10-3 10-4

• Examinar las placas y seleccionar las

que contengan hasta 250-300 colonias
totales típicas y no típicas.

• Para realizar el cálculo se eligen las

placas de dos diluciones sucesivas
donde al menos una placa de las
seleccionadas contenga un mínimo de
10 colonias típicas.

• Confirmación/identificación de las
colonias sospechosas. Recuento presuntivo: ∑ Nº colonias X Factor de dilución
 Pruebas confirmativas

Seleccionar 10 o mas colonias (típicas y

atípicas) sospechosas y realizar:

- Prueba Oxidasa
- Prueba de fermentación de la glucosa Prueba Oxidasa
(medio glucosa-sal cubierta con parafina
sólida).

Las colonias pertenecientes a la Familia de

Enterobacteriaceae dan la prueba:
oxidasa negativa y
fermentan la glucosa.
Fermentación de la glucosa
Recuento Confirmativo de Enterobacteriaceas:

Recuento presuntivo=
∑ Nº colonias X Factor de dilución

Recuento Confirmativo=

Rto. presuntivo X Nº de colonias confirmadas

_________________________________

Nº de colonias ensayadas
 Dilución Placa 1 Placa 2
-1 incontables incontables
-2 600 640
-3 200 180
Promedio: 190
-4 4 2

Recuento presuntivo: ∑ Nº colonias X Factor de dilución

Recuento presuntivo: 190 x 103 = 1,9 x 105 UFC/g

Nº de colonias confirmadas
Recuento Confirmativo= Rto. presuntivo X Nº de colonias ensayadas

Ej 1: Recuento Confirmativo= 1,9 x 10 5 UFC/g x 10 = 1,9 x 105UFC/g

10

Ej 2: Recuento Confirmativo= 1,9 x 105 UFC/g x 2 = 3,8 x 104 UFC/g

10
Siembra.
Agar VRBG
 Agar selectivo y
diferencial.
• Sales biliares
• Glucosa y rojo neutro

¿Cómo calcular cantidad

de medio a preparar?

¿Cómo saber cuánto

pesar?
¿Cómo calcular cantidad de medio a preparar?

 Generalmente de CADA muestra se siembran 3 diluciones

seguidas en duplicado (por lo tanto son 6 placas).
 Cada placa requiere un volumen entre 15 y 20 ml (h>4mm)
 Por lo tanto, requiero preparar 20 ml x 6= 120 ml mínimo
Siempre considerar placas control!!! (1 o 2)= 40 ml
 Luego se debe agregar 5 ml de cobertura por placa, por lo
tanto son 5 ml x 6 placas = 30ml
Para 1 muestra se requiere:
120+40+30 = 190 ml aprox 200ml
Calcular medio necesario:
Debe analizar 5 muestras de queso para determinar aceptación o rechazo de un lote 
Siembra en duplicado -1, -2 y -3
D 1 2 3
10*2 10 1

10*3 10*2 10 1

RESPUESTA
Número de muestras =
Nº placas/muestra =
mL/placa
Nº placas control
Cobertura /placa
TOTAL
5 muestras
3 x 2 = 6 placas
20 mL
2 placas  40mL
5 ml
((20 mL x 6 placas) + (5 ml x 6 placas)) x 5 muestras) + 40 mL
790 mL  800 mL
 Preparación de medios

Ejercicio : ¿Cuánto debo medio preparar?

Calcule la cantidad de medio VRBG que debe prepara
para analizar 2 muestras.
 Suspender 41,5 gramos del medio en un litro de agua
destilada. Mezclar bien y disolver con calor y agitación
frecuente. Hervir durante un minuto hasta
disolver completamente. Enfriar a 47-50°C y dispensar
inmediatamente. NO SOBRECALENTAR.

¿Cuánto medio de cultivo debo pesar?

 En la etiqueta del envase siempre sale la cantidad de g
que se debe pesar por 1 litro de medio.
 Calcular cantidad de medio de cultivo necesario según
muestras
 Aplicar regla de 3.
Ej: Disolver 41,5 gr en 1 litro de agua destilada
 Medir pH!!!! CALCULO
Para 1000 ml ------- 41,5 g
350 ml -------- x
X= 350 x 41,5/1000
X= 14,5 g + 350 ml de H2O
Ejercicio Dilución Placa 1 Placa 2
-1 NMPC NPC
-2 NMPC NMPC
-3 600 800
-4 80 100

Recuento presuntivo: ∑ Nº colonias X Factor de dilución

Recuento presuntivo:

Nº de colonias confirmadas
Recuento Confirmativo= Rto. presuntivo X Nº de colonias ensayadas

SE SELECIONAN 12 COLONIA Y 8/12 DAN OXIDADASA – Y FERMENTACION GLUCOSA

Ej 1: Recuento Confirmativo=
GRACIAS