INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“José María Morelos y Pavón”

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

Práctica 4. Determinación de coliformes

totales por cuenta en placa.

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Alumnos:
López Gutiérrez José Abraham
Romero Serna Jessica
Torres Guzmán Jesús Artemio
Villa Arreola Ignacio

01 de marzo de 2018 Morelia, Mich.

Introducción.
La presencia de microorganismos indicadores hace referencia a la calidad del alimento o
para predecir la durabilidad del mismo. Los indicadores son específicos de cada producto
pero en general deben satisfacer los criterios siguientes: deben estar presentes y ser
detectables en todos los alimentos cuya calidad deba ser evaluada, su multiplicación y
cantidad deben ser inversamente proporcionales a la calidad del producto, se deben poder
detectar y contar de manera fácil y en poco tiempo, debe ser posible diferenciarlos de otros
organismos y su proliferación no puede ser interferida por la flora normal del alimento en
estudio (Jay, 2002).
El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
• La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de
los alimentos.
• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no
necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-
fecal.
• Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo.
• La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes
áreas del procesamiento de alimentos.
Los coliformes totales incluyen una amplia variedad de bacilos aerobios y anaerobios
facultativos, gramnegativos y no esporulantes capaces de proliferar en presencia de
concentraciones relativamente altas de sales biliares fermentando la lactosa y produciendo
ácido o aldehído en 24 h a una temperatura que oscila entre 35 y 37 °C. Escherichia coli y
los coliformes termotolerantes son un subgrupo de los coliformes totales que pueden
fermentar la lactosa a temperaturas más altas. Los coliformes totales producen, para
fermentar la lactosa, la enzima β-galactosidasa. Tradicionalmente, se consideraba que las
bacterias coliformes pertenecían a los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y
Enterobacter, pero el grupo es más heterogéneo e incluye otros géneros como Serratia y
Hafnia. El grupo de los coliformes totales incluye especies fecales y ambientales. (Total de
bacterias coliformes , s.f.)
Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan
en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador
rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro
y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro
o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación,
como se explicó en la técnica de preparación de diluciones. (Camacho, 2009)
El procedimiento realizado es el de cualquier tipo de conteo, obtener la muestra, realizar
las disoluciones con solución salina de peptona, vaciar el medio a las cajas y sembrar los
microorganismos a partir de las disoluciones ya realizadas, y seleccionas las cajas de Petri
para los cálculos se deben considerar a las más “representativas “, estas cajas tienen un
número de colonias dentro del rango de sensibilidad del método, en este caso, entre 15 y
150 UFC. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se
aplica el factor de dilución, que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas
(o dígitos) y potencias de 10.
Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran ésta ni su duplicado,
pero cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se
consideran ambas y se promedian. Si no hay placas representativas, pero hay alguna con
un número menor de UFC., se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor
estimado”.
En los casos donde el número de colonias por placa exceda de 150, contar las colonias en
aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias.

Ilustración 1 pasos a seguir para la determinación de coliformes totales por cuenta

en placa.

Objetivos generales.
1. Comprender y realizar adecuadamente la determinación de coliformes totales en un
alimento, mediante la cuenta en placas vertidas.
2. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

Reactivos
• 1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos
de pH 7.0 ± 0.2 o agua peptonada
• 2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca, con 9.0 mL de solución
amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 ± 0.2 o agua peptonada.
• 5 a 9 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta
c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL.

Material y equipo

 Incubadora con termostato

 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador
  Registrador mecánico o electrónico
 Microscopio óptico
 Utensilios estériles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra
 Pipetas bacteriológicas de 10 mL, estériles
 Pipetas bacteriológicas de 1 mL, estériles
 Varillas de vidrio estériles (en escuadra o “L”)
 Pipetas Pasteur estériles
 8 a 12 cajas Petri estériles
Diagrama de flujo

Preparar el medio Encender el

de cultivo de acuerdo Esterilizar el material a Limpiar y desinfectar
a las utilizar (autoclave a 15
la mesa de trabajo
mechero Fischer y
lbf/in2 y 121°C, 15- crear el radio de
especificaciones del 20min) con solución Benzal
fabricante. esterilidad.

Se inocula por Distribuir las cajas Pesar la muestra y preparar

Se mezcla duplicado ( 1ml de la
cuidadosamente el disolución con 20ml
inóculo con el medio aprox. del medio
ABRV)
estériles en la mesa de las disoluciones como lo
trabajo para una establece la técnica de
apropiada inoculación y preparación y dilución de
adición de medio de muestras de alimentos para
cultivo su análisis microbiológico

Conteo de colonias Conteo de colonias

Preparar una caja Incubar las cajas (Seleccionar las
(Seleccionar las
control con 18 o 20 debidamente placas que contegan
placas que contegan
ml del medio para selladas a 35°C, entre 15 - 150
entre 15 - 150
verificar esterilidad durante 24±2 h colonias)
colonias)

Resultados
Se utilizó cilantro para realizar la práctica, y haciendo disoluciones hasta 10-5 (la prueba se
realizó por duplicado) Imagen 2; se observó que en las placas no se contaminaron, y que
si se formaron las precipitaciones (formación de los halos por acción de las sales biliares),
además en la disolución de 10-4 había poco contenido de colonias y en la última disolución
no se presentaban colonias.

Ilustración 2 Placas después de la incubación.

La placa número 3 que corresponde a la disolución de 10-3 Imagen 3, donde a simple vista
no se rebasa el número de colonias establecidas anteriormente para el conteo, dando como
resultado 108 y 90 Por lo que el promedio corresponde a 94 que en términos de expresión
para estos procedimientos será de 90 y al corresponder a la disolución de 10-3 se concluye
que el resultado de los microorganismos presentes es de 9X10-2 UFC/gr

Placa A Placa B
Ilustración 3 Placas utilizadas para el conteo de colonias

Discusión de Resultados
Durante desarrollo de la práctica no se tuvo el debido cuidado de observar el medio de
cultivo periódicamente, por lo que comenzó a solidificarse y a la hora de verter sobre
las placas de Petri este salió en forma gelatinosa, lo cual complicó que el inoculo y medio
de cultivo se mezclaran.
El medio de cultivo solidificado pudo causar errores en los resultados obtenidos debido a
que se dificultaba el conteo de las colonias, por lo que se debe tener mayor cuidado con el
manejo de la muestra y el tiempo que tarda el medio de cultivo en solidificarse para evitar
que vuelva a ocurrir y los resultados sean confiables.
Se pudo observar en las placas la presencia de coliformes debido a que el halo de las sales
biliares color rosa rodeaba un pequeño punto rojo oscuro, por lo tanto se confirma que el
alimento (cilantro) es de calidad e inocuidad deficiente, por lo que siempre se deben de
lavar y desinfectar este tipo de alimentos aunque la cantidad de microorganismos contenida
no presente un riesgo sanitario.
Conclusión.
Hoy en día se ha tomado más auge sobre las buenas prácticas en la producción de los
alimentos, y hay indicadores tanto para saber el grado de contaminación o del mal manejo
que se tuvo a la hora de procesar el alimento, en este caso se comprendio el uso de
indicadores sanitarios, ya que, es de gran importancia conocer si el proceso realizado fue
correcto, y con esta herramienta del conteo de la determinación de coliformes totales, nos
podemos dar cuenta de la calidad del alimento al final dl proceso y si este tuvo un buen o
mal manejo de forma higiénica.
Bibliografía
Camacho, A. M. (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2. (F. d. Química,
Ed.) UNAM, México. Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasic-Diluciones_6526.pdf

Total de bacterias coliformes . (s.f.). Obtenido de http://www.bvsde.paho.org/cd-

gdwq/docs_microbiologicos/Indicadores%20PDF/bacterias%20coliformes.pdf

Jay J. Microbiología Moderna de los Alimentos. Editorial Acribia S.A: Zaragoza (España). 2002,
4 edición, 615 pp.