Está en la página 1de 14

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

C.E.C.yT. 6 “Miguel Othón de Mendizábal”


CARRERA ACREDITADA DE TECNICO LABORATORISTA
QUÍMICO.

Nombre de la práctica: PRÁCTICA No. 9 Tiempo: 3 Hrs.

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y Unidad III


FECALES EN PLACA Y POR NMP EN UN
ALIMENTO. Fecha:

UNIDAD DE APRENDIZAJE: CONTROL SANITARIO MICROBIOLÓGICO.


COMPETENCIA DE APRENDIZAJE: Realiza el recuento de organismos coliformes totales y fecales
usando técnicas establecidas en la normatividad respectiva.

RESULTADO DE APRENDIZAJE PROPUESTO (RAP) ASOCIADO CON LA PRÁCTICA. RAP N° 1.- Realiza el
recuento de organismos coliformes totales en placa y por NMP así como el recuento de
organismos coliformes fecales por la técnica anterior.

INTRODUCCIÓN:

La palabra coliforme etimológicamente significa “con forma de coli”, refiriéndose a la bacteria


representativa del grupo, Escherichia coli; descubierta por el bacteriólogo alemán Theodor Von Escherich en
1860, quien la denominó “Bacterium coli” (bacteria del intestino). Posteriormente la microbiología
sistemática la nombraría Escherichia en honor a su descubridor.

El hábitat primordial de este grupo heterogéneo de bacterias es el intestino del hombre y otros animales, lo
cual explica su amplia distribución en el suelo, semillas y vegetales. Tales microorganismos presentan las
siguientes propiedades bioquímicas:

• Son bacilos Gram negativos.


• Son aerobios o anaerobios facultativos.
• Son oxidasa negativos.
• No son esporógenos (no producen esporas).
• Fermentan la lactosa a 35 ± 2 °C/48 hrs, produciendo ácido láctico y gas.

Este grupo bacteriano, sin guardar forzosamente una relación directa con una contaminación fecal y por
tanto no necesariamente patógena, está formado por los siguientes microorganismos:
62
1. Escherichia coli
2. Klebsiella pneumoniae
3. Enterobacter aerogenes
4. Enterobacter cloacae
5. Citrobacter (aunque no todos los autores lo incluyen en el grupo coliforme)

La importancia de cuantificar estos organismos coliformes es que se usan como indicador sanitario para:

• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente


implica un riesgo sanitario.
• La evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo.
• Evaluar la calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de
alimentos.
• La evaluación de la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas frescas,
fórmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno.

Fundamentalmente el método en placa permite determinar el número de microorganismos coliformes


presentes en una muestra utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis), en el cual se desarrollan
bacterias a 35° C en aproximadamente 24 horas, dando como resultado la producción de gas y ácidos
orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan sales biliares.

Por otra parte, si el recuento de coliformes se efectuara en medios de cultivo líquidos se aplica la técnica del
recuento de organismos coliformes por la técnica del número más probable (NMP), la cual es seleccionada
cuando la densidad es como mínimo una bacteria en 1 mL. de producto líquido o gramo de alimento sólido;
como ya se mencionó en esta técnica se utilizan medios de cultivo líquidos en tubos de ensaye provistos de
pequeños tubos de cristal invertidos, de tal forma que puedan atrapar en su interior el gas desprendido por
las bacterias al metabolizar la lactosa.

Esta técnica se efectúa en dos partes; la primera que es una prueba presuntiva, utilizando caldo lactosado o
caldo lauril sulfato (a 35± 2°C/48 hrs.); bajo tales condiciones de incubación, los coliformes fermentan la
lactosa produciendo gas; En la segunda fase, conocida como fase confirmativa se utiliza caldo de bilis verde
brillante al 2% con campana de Durham o campana de fermentación incubados en las mismas condiciones
anteriormente explicadas; este medio al contener bilis deshidratada de buey y verde brillante, inhibe el
crecimiento de los microorganismos aerobios fermentadores de lactosa como por ejemplo Clostridium
perfringens, el cual ocasionaría resultados falsos positivos.

Los coliformes fecales al fermentar la lactosa a 44.5 ± 0.2°C, permiten descartar al género Enterobacter (el
cual no crece a esta temperatura); aplicando este criterio, principalmente crecerá Escherichia coli (en un
90%) y algunas cepas de Klebsiella y Citrobacter; por lo que la prueba de coliformes fecales positiva indica
un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea Escherichia coli.

Para el caso particular, los niveles permisibles de microorganismos coliformes fecales en agua, de acuerdo a
la norma son:

• Agua potable: menor a 0 UFC/100 mL. de muestra de agua.


63
• Agua para natación: menor de 200 UFC/100 mL. de muestra de agua.

• Agua para navegar o pescar: menor de 1,000 UFC/100 mL. de muestra de agua.

Debemos tener presente que el aislamiento de Escherichia coli en el agua, da un alto grado de certeza de
contaminación de origen fecal; no es absoluto ya que se han aislado cepas de Escherichia coli que no son de
origen fecal, pero el grado de certeza es más que razonable para certificar contaminación con ese origen.

Aunque el aislamiento de Escherichia coli no permite distinguir si la contaminación proviene de excretas


humanas o animales, la contaminación que se desea controlar es la de origen humano, lo cual no significa
que debemos menospreciar la de origen animal, especialmente por la zoonosis que también puede
transmitirse por el agua por lo que los coliformes fecales también son usados para evaluar sanitariamente
mariscos frescos. En lo particular, Escherichia coli se usa como indicador en quesos, quesillos, cereales,
masas para relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO:

• Mechero
• Frasco de vidrio para recolectar especímenes de de 125 mL con 90 mL de solución diluyente estéril
• Tubos de ensaye de 15 x 150 con 9 mL. de solución diluyente estéril
• Agar bilis rojo violeta estéril conservado a 45/50°C en baño maría
• Pipetas graduadas estériles de 1 y 10 mL
• Cajas de Petri estériles
• Horno bacteriológico
• Asa bacteriológica
• Gradilla metálica para 72 tubos
• Espátula estéril.
• Balanza granataria.
• Tubos de ensaye con campana de Durham y caldo lactosado o caldo lauril sulfato estéril.
• Tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2% con campana de Durham estéril.
• Tubos de ensaye de 20x180 conteniendo 10 mL. de caldo lauril sulfato triptosa estéril con campana
de
Durham.
• Tubos con caldo EC estéril.
• Tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2% en agua peptonada estéril.
• Baño maría a 44.5 ± 0.2°C.
• Reactivo de Kovac.
• Estufa bacteriológica.
• Refrigerador.
• Autoclave.

64
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA.

(ROTULE PREVIAMENTE CAJAS DE PETRI, TUBOS Y PIPETAS).

1. En condiciones de asepsia, hacer una serie de diluciones decimales de 10-1 hasta 10-5.
2. Marcar 3 cajas de Petri como 10-1, 10-3 y 10-5.
3. Inocular estas cajas con 1 mL de la dilución respectiva.
4. Agregar 12-15 mL de agar rojo violeta bilis (RVBA) mantenido a 45-50 °C en baño maría.
5. Sobre la mesa de trabajo, homogeneizar el inóculo y el medio de cultivo utilizando movimientos
circulares suaves y hacia los cuatro puntos cardinales.
6. Dejar solidificar.
7. Adicionar aproximadamente 4 mL. de RVBA a 45-50 °C, de tal manera que cubra la superficie de la
placa, formando una doble capa.
8. Dejar solidificar.
9. Invertir las cajas e incubar a 35± 2°C/24± 2 hrs.

65
10. Seleccionar la placa que contenga entre 15 y 150 colonias típicas esto es, de color rojo oscuro,
generalmente rodeadas de un halo de precipitación de sales biliares, el cual es de color rosa o rojo ,
biconvexas con un diámetro de 0.5-2.0 mm.
11. Contar las colonias típicas y multiplicar por el inverso de la dilución.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

a.- Reportar: ______ UFC de coliformes/g. o mL. de muestra, en placa de agar rojo violeta bilis
incubadas a 35± 2°C/24± 2 hrs.

NOTA 1: Si no hay colonias características, entonces:

Reportar: ______ menos de un coliforme por 1/d por g. o mL. de muestra (donde d, es el factor de
dilución).

NOTA 2: Ocasionalmente los cocos intestinales forman colonias puntiformes de


color rosa.

b.- Considerando el resultado obtenido y con base en las NOM̕ѕ: NOM-092-SSA1-1994, NOM-093-SSA1-
1994, NOM-121-SSA1-1994, NOM-117-SSA1-1994, NOM-114-SSA1-1994 y NOM-145-SSA1-1995; emita el
criterio de aceptación microbiológica.

c.- Con los resultados de todos los equipos, haga un cuadro en el pizarrón y discútalo en grupo.

66
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES POR NÚMERO MAS PROBABLE (NMP)

Esta técnica se efectúa en dos partes; en la primera que es una prueba presuntiva, se utiliza caldo de
lactosa o caldo de laurilsulfato, los cuales liberan gas al ser fermentados por los coliformes; en la segunda
fase, conocida como confirmativa, se utiliza caldo lactosa bilis verde brillante al 2% con campana de Durham
o campana de fermentación.

(ROTULE PREVIAMENTE CAJAS DE PETRI, TUBOS Y PIPETAS).

67
68
PRUEBA PRESUNTIVA

1. Realizar una serie de diluciones decimales hasta 10-3.


2. Inocular 1 mL. de cada dilución en cada uno de los tres tubos conteniendo 10 mL. de caldo de
lactosa o caldo de laurilsulfato con campana de Durham.
3. Incubar los 9 tubos a 35 ± 2°C/48± 2hrs.
4. Revisar los tubos a las 24 ± 2 hrs (esto para observar si hay producción de gas en las campanas de
Durham); de no ser así, seguir incubando hasta las 48 ± 2 hrs.

NOTA: La presencia de cualquier cantidad de gas dentro de la campana indica muestra positiva; por lo que,
si después de 48 ± 2 hrs., todos los tubos resultan negativos, ahí finaliza la prueba.

PRUEBA CONFIRMATIVA

1. Agitar suavemente aquellos tubos que dieron positiva la prueba presuntiva.


2. De cada uno de ellos, inocular con 2-3 asadas a tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2%
(previamente rotulados).

NOTA: Al efectuar la inoculación, sostener el tubo positivo de tal modo que pueda sacar el asa, evitando el arrastre de la “nata”
presente en el medio.

3. Incubar los tubos con caldo a 35 ± 2°C/48 ± 2 hrs.


4. Determinar el número de microorganismos coliformes de acuerdo a la tabla correspondiente
tomando como base el número de tubos positivos; esto es, en los que se observa producción de gas.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

Reportar: ____________ Número más probable (NMP) de coliformes totales por g. o mL. de muestra

69
TABLA PARA DETERMINAR EL NMP DE ORGANISMOS
CUANDO SE UTILIZAN 3 TUBOS PARA CADA DILUCIÓN

De acuerdo al número 3 con 1 mL. de dilución 1:10 = 0.1 g. de muestra


de tubos inoculados 3 con 1 mL. de dilución 1:100 = 0.01 g. de muestra
3 con 1 mL. de dilución 1:1000 = 0.001 g. de muestra

Tubos positivos Tubos positivos

3 3 3 NMP/g. o mL. 3 3 3 NMP/g. o mL.


(0.1) (0.01) (0.001) (0.1) (0.01) (0.001)

0 0 0 -3.0 2 0 0 9.1
0 0 1 3.0 2 0 1 14.0
0 0 2 6.0 2 0 2 20.0
0 0 3 9.0 2 0 3 26.0
0 1 0 3.0 2 1 0 15.0
0 1 1 6.1 2 1 1 20.0
0 1 2 9.2 2 1 2 27.0
0 1 3 12.0 2 1 3 34.0
0 2 0 6.2 2 2 0 21.0
0 2 1 9.3 2 2 1 28.0
0 2 2 12.0 2 2 2 35.0
0 2 3 16.0 2 2 3 42.0
0 3 0 9.4 2 3 0 29.0
0 3 1 13.0 2 3 1 36.0
0 3 2 16.0 2 3 2 44.0
0 3 3 19.0 2 3 3 53.0
1 0 0 3.6 3 0 0 23.0
1 0 1 7.2 3 0 1 39.0
1 0 2 11.0 3 0 2 64.0
1 0 3 15.0 3 0 3 95.0
1 1 0 7.3 3 1 0 43.0
1 1 1 11.0 3 1 1 75.0
1 1 2 15.0 3 1 2 120.0
1 1 3 19.0 3 1 3 160.0
1 2 0 11.0 3 2 0 93.0
1 2 1 15.0 3 2 1 150.0
1 2 2 20.0 3 2 2 210.0
1 2 3 24.0 3 2 3 290.0
1 3 0 16.0 3 3 0 240.0
1 3 1 20.0 3 3 1 460.0
1 3 2 24.0 3 3 2 1100.0
1 3 3 29.0 3 3 3 >1100.0

70
Así, por ejemplo:

Suponga que al final del análisis se obtuvo un tubo positivo de la dilución 10-1, dos de la dilución 10-2 y cero
de la dilución 10-3, luego entonces el resultado será de 11 por lo que usted deberá reportar:

Número más probable (NMP) de organismos coliformes totales por g. o mL. de muestra = 11

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

a. De acuerdo a su reporte y con base a la NOM respectiva emita un juicio sobre la calidad sanitaria del
alimento en estudio.

b. Con los resultados de cada uno de los equipos de su grupo, elabore un cuadro comparativo y discuta
los resultados.

c. Emita su opinión en cuanto a la aceptación microbiológica de cada uno de los alimentos.

71
RECUENTO DE COLIFORMES FECALES POR NMP.

Dado que no todos los coliformes son de origen fecal, fue necesario desarrollar técnicas para diferenciarlos
y poder emplearlos como indicadores de contaminación; distinguiéndose por tanto, los coliformes totales
de los coliformes fecales. Esta diferenciación permite asegurar con un alto grado de certeza, si la
contaminación en la muestra es de origen fecal y por tanto, el inminente riesgo de adquirir otras patologías
de etiología diferente como las producidas por protozoarios intestinales, metazoarios, virus, levaduras, etc.

PARTE EXPERIMENTAL. (ROTULE PREVIAMENTE CAJAS DE PETRI, TUBOS Y PIPETAS).

72
PRUEBA PRESUNTIVA:

1. A partir de la muestra, realizar una serie de diluciones decimales de 10-1 hasta 10-3.
2. Inocular 1.0 mL. de cada dilución en cada uno de los tres tubos, los cuales contienen 10 mL. de
caldo de laurilsulfato, caldo de lactosa o caldo MacConkey con campana de Durham (campana de
fermentación).
3. Incubar a 35± 2 °C durante 48 ± 2 hrs.

NOTA: Examinar los tubos a las 24 ± 2 hrs y observar si hay gas acumulado en la campana; de no ser así,
seguir incubando hasta las 48 ± 2 hrs (la presencia de gas dentro de la campana, indica prueba positiva)

PRUEBA CONFIRMATIVA:

4. Agitar suavemente los tubos que hayan resultado positivos.


5. Inocular con 2-3 asadas de cada tubo positivo a otro con caldo EC (Eijkman); y de igual manera
inocular en caldo lactosa bilis verde brillante al 2% en agua peptonada (Mackenzie).
6. Incubar a 44.5 ± 0.2 °C en baño maría.
7. Observar si hay producción de gas a las 24-48 hrs. (la presencia de gas dentro de la campana, indica
prueba positiva).
8. A los tubos con agua peptonada, agregar 2-3 gotas de reactivo de Kovac (para la prueba de indol);
la presencia de una coloración roja hace positiva la prueba.
9. Consultar la tabla para reporte de resultados.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

a. Usando la tabla para determinar el NMP de organismos, cuando son usados 3 tubos para cada
dilución, haga el reporte correspondiente.

b. De acuerdo a los resultados de su equipo llene el siguiente informe:

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA: ______________________________________________

COLIFORMES TOTALES EN PLACA: _______________________________________________

COLIFORMES TOTALES POR NMP: _______________________________________________

COLIFORMES FECALES POR NMP: _______________________________________________

73
c. Con los resultados de los equipos de su grupo haga un cuadro y discuta los resultados.

d. Compare los resultados y con base en la NOM, emita un juicio relativo a la aceptación o rechazo del
alimento en función de su carga microbiana.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la intención de formar una doble capa de medio de cultivo en la determinación de


coliformes totales en placa?

2. ¿Cuáles son los constituyentes que permiten que el RVBA sea un medio selectivo y diferencial al
mismo tiempo?

3. ¿Cuál es la morfología colonial típica de los coliformes en RVBA?

4. Mencione por lo menos 3 características bioquímicas de los coliformes.

5. Si los organismos coliformes no están necesariamente relacionados con contaminación fecal ¿Por
qué desde el punto de vista práctico se determinan coliformes?

74
6. ¿Qué entiende por zoonosis?

7. De acuerdo a la temperatura óptima de crecimiento. ¿Qué tipo de microorganismo es Escherichia


coli?

DISCUSIÓN:

CONCLUSIÓN(ES):

EL ALUMNO DEBE CONSULTAR Y ANOTAR UN MÍNIMO DE 3 CITAS BIBLIOGRÁFICAS.

75

También podría gustarte