PROTOCOLO DE VALIDACION DE PRUEBA DE APTITUD PARA ENSAYOS DE ESTERILIDAD.

1. OBJETIVO

2. ALCANCE

3. RESPONSABILIDADES

4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR

5. METODOLOGA DE VALIDACIN

6. CONCLUSIONES

7. RECOMENDACIONES

1. OBJETIVO:
 Demostrar mediante evidencia documentada que la metodologa para evaluar la esterilidad de
los geles y ungentos, est totalmente bajo control y proporciona de forma consistente y
reproducible resultados que cumplen las especificaciones establecidas.

2. ALCANCE:

Este protocolo se utilizar para la validacin de pruebas de aptitud para ensayos de esterilidad
en geles oftlmicos, as tambin en ungentos oftlmicos

3. RESPONSABILIDAD:

3.1. Analista de Microbiologa, es responsable de Disear, planificar, desarrollar, registrar datos y

de preparar el reporte de validacin, adjuntando toda la documentacin pertinente.
3.2. Jefe de Control de Calidad, es responsable de vigilar la correcta ejecucin de la validacin
3.3. Jefe de Validaciones, es el responsable de mantener vigente la calificacin de los equipos y
calibracin de los instrumentos de medicin utilizados en la validacin.
3.4. Jefe de Aseguramiento de la Calidad es el encargado de la coordinacin de las actividades
que genere la validacin, as como de colaborar en la revisin de la documentacin propia
del proceso de validacin.
3.5. El Director Tcnico es responsable de la aprobacin del Reporte Final de la Validacin y de
darlo a conocer a los involucrados.
4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR

4.1. Equipos

FECHA
NOMBRE MARCA CDIGO
CALIBRACIN
Cabina de bioseguridad
Balanza de precisin
Estufa de Incubacin 30-35C
Autoclave
Refrigeradora de 2-8C
Espectrofotmetro

4.2. Materiales de vidrio y accesorios

FECHA
NOMBRE MARCA CDIGO
CALIBRACIN
Frascos x 100 mL con tapa
Frasco x 250 Ml con tapa
Pipeteador variable (1-10mL)
Placa Petri descartable 90x15mm

4.3. Material de referencia, producto y activos

FECHA
NOMBRE MARCA LOTE
VENCIMIENTO
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Bacillus subtilis ATCC 6633
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
Candida albicans ATCC 10231

4.4. Medios de Cultivo, reactivos y excipientes

FECHA
NOMBRE MARCA LOTE
VENCIMIENTO
Agar CASO
Agar Sabouraud
Polisorbato 80
5. METODOLOGA DE VALIDACIN:

5.1. Consideraciones Generales

Los medios a usar deben haber pasado por un proceso de esterilizacin y luego debe
establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios. Analizar cada lote de
medio a usar, segn procedimiento PROMOCION DE CRECIMIENTO Y CONTROL
NEGATIVO DE MEDIOS DE CULTIVO

5.2. Referencias:

USP 39. Pruebas Microbiologicas / <11> Pruebas de Esterilidad. Pag. 146-153.

5.3. Preparacin de la suspensin microbiana

5.3.1.Usar microorganismo subcultivados de cepas de referencia. Los microorganismos de

prueba deben corresponder a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra
maestro original, y formar parte de un cultivo de crecimiento reciente. Cultivar por
separado cada cepa bacteriana y fngica de prueba (ver la Tabla N1).

Tabla N1: Cepas de Microorganismos de prueba adecuados para usar en la Prueba de

Aptitud del Mtodo

5.3.2.Cultivar las bacterias aerobias en Agar CASO, e incubar de 30-35C x 18-24 horas.
5.3.3.Cultivar Clostridium sporogenes, en condiciones anaerbicas en Agar CASO a una
temperatura de 30-35 C durante un perodo de 24 a 48 horas.
5.3.4.Cultivar C. albicans y A. brasiliensis en Agar Sabouraud Dextroxa a una temperatura de
20-25C durante un periodo de 2-3 das para C. albicans, y 5-7 das para A. niger.
5.3.5.Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solucin salina SR
estril, lavar la superficie de crecimiento y recogerlo en un recipiente adecuado. Para
cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solucin salina SR estril que contenga
0,05% de polisorbato 80. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las
24 horas si se almacenan a una temperatura entre 2C y 8C.
5.3.6.Para obtener un inculo de aproximadamente 100 ufc, diluya la suspensin microbiana
con solucin salina hasta obtener una transmitancia de aproximadamente 30% a una
longitud de onda de 580nm. Obtenida esta transmitancia realice diluciones seriadas
agragando 1 mL de inoculo en 9 mL de solucin salina, repetir hasta obtener 10 -5 de la
solucin original. A cada medio inocular 100 uL de la solucin 10 -5, as obtendr
aproximadamente 100 ufc.
5.3.7.Verificar la carga microbiana inoculando 100 uL de la dilucin 10 -5 del microorganismo
evaluado en 2 placas estriles, luego agregar de 15-20 mL de medio licuados
previamente y mantenidos a 45 C. Para bacterias usa Agar CASO, y para hongos y
levaduras usar Agar Sabouraud. Incubar por el tiempo y temperatura segn lo indicado
en los puntos 5.3.2 al 5.3.4

5.4. Prueba de Aptitud del Mtodo:

5.4.1.En Geles por Inoculacin directa
5.4.1.1. Transferir directamente 10 g aproximadamente del producto a examinar en 90
mL de Caldo CASO y 90 mL de Caldo Tioglicolato ambos al 1% de Polisorbato 80.

5.4.2.En Ungentos por Inoculacin directa:

5.4.2.1. Agregar aproximadamente 5 g de producto en 100 mL de Agua al 0,1% de
peptona y 1% de Polisorbato 80, mantenida a 40C aproximadamente. Agitar para
lograr la emulsin del producto.
5.4.2.2. Transferir aproximadamente 50 mL de producto diluido a 50 mL de Caldo
CASO y los restantes 500 mL de producto diluido a 50 mL de Caldo Tioglicolato,
ambos medios preparados a doble concentracin.
5.4.3.En Ungentos por Filtracin por Membrana:
5.4.3.1. Agregar 4 g de ungento en 400 mL de Miristato de Isopropilo calentado a no
ms de 44C. Agitar hasta lograr la emulsin.
5.4.3.2. Usar filtros de membrana con un tamao nominal de poro no mayor de 0,45
m, y de aproximadamente 47 mm de dimetro.
5.4.3.3. Filtrar 100 mL de Solucin de peptona al 1% atemperada a 40 C,
inmediatamente filtrar la emulsin de producto en miristato. Luego de filtrado el
producto, lavar la membrana filtrando 2 veces 100 mL de solucin de peptona al
1% con 1% de polisorbato 80.
5.4.3.4. Cortar aspticamente la membrana en dos partes iguales y transferir cada
mitad a tubos conteniendo 30 mL de caldo CASO y 30 mL de Caldo Tioglicolato.
5.4.4. Agregar al medio un inculo de un nmero pequeo de microorganismos viables (no
ms de 100 ufc). Al caldo Tioglicolato inocular: Clostridium sporogenes, Pseudomonas
aeruginosa y Staphylococcus aureus. Al caldo CASO inocular: Aspergillus brasilensis,
Bacillus subtlis y Candida albicans. Considerar la inoculacin por separado de cada
uno de los microorganismos indicados.
5.4.5.Realizar controles positivos del medio inoculando microorganismo de prueba pero sin
agregar producto.
5.4.6.Realizar controles negativos de cada medio (medio sin inculo ni producto agregado).
5.4.7.Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no ms de 5 das. Incubar
Caldo Tioglicolato 30-35C y el caldo CASO a 22,5 2,5C.

5.4.8.Interpretacin de resultados:

Si despus de la incubacin se obtiene un crecimiento claramente visible de

microorganismos, comparable visualmente con el del recipiente de control sin producto,
el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal
actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces
llevarse a cabo sin otras modificaciones.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar,
comparable visualmente con el de los recipientes de control sin producto, el producto
posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las
condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad
antimicrobiana y repetir la Prueba de Aptitud del Mtodo.
Esta prueba de aptitud del mtodo se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad
tiene que realizarse en un producto nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las
condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del mtodo podr
llevarse a cabo simultneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.

5.4.9.Criterio de aceptacin:
5.4.9.1. Recuperacin de los microorganismos inoculados en presencia de producto,
manifestada por la turbidez
5.4.9.2. Ausencia de crecimiento en los controles negativos
5.4.9.3. Presencia de crecimiento en los controles positivos