NUMERACIÓNDE

C O L I F O R M E S,
DETERMINANCIÓNDEL
NÚMEROMÁSPROBABLE

(N M P)

Docente: linley salomón vega

Nombre: juan Carlos Huanchi Condori
Curso: microbiología de alimentos ii
Código: 2017-111008
Tema: coliformes

2020 COLIFORMES
 1. OBJETIVO:

 Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de alimentos.

 determinar la numeración coliformes mediante el método de recuento de
placa.
 Determinar el NMP de coliformes fecales en muestras de alimentos.

2. FUNDAMENTO TEORICO:

La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que

tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como
indicadores de contaminación del agua y los alimentos.

La denominación genérica coliformes, designa a un grupo de especies bacterianas que

tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como
indicadores de contaminación del agua y los alimentos.

-CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

El grupo aplica a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por tener las
siguientes propiedades bioquímicas:

 Aerobios o anaerobios facultativos.

 Bacillos Gram negativos
 No ser esporóngenas
 Capaces de fermentar la lactosa a 35ºC en 48 horas, produciendo ácido láctico
y gas.

-Coliformes totales y Coliformes Termo tolerantes

No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar
pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de
contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales —que comprende la
totalidad del grupo— y los coliformes fecales —aquellos de origen intestinal—.

Desde el punto de vista de la salud pública esta diferenciación es importante puesto

que permite asegurar con alto grado de certeza que la contaminación que presenta el
agua es de origen fecal.

Para recordar:

Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino delos

humanos y de los animales de sangre caliente; es decir; homeotermos, pero también
ampliamente distribuida en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y
vegetales.
Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de
humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes
se encuentran en el medio ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos
coliformes de vida libre.

FUENTES DE CONTAMINACIÓN
 Suelo
 Agua en todas sus fuentes
 Tracto digestivo de humano
 Tracto digestivo animales

3. Equipos y materiales:
Instrumentos Equipos

 Placas Petri (6)  Contador de colonias

 Tubos de ensayo (25)  Baño de agua regulado a 40 °C para
 Pipetas bacteriológicas de 10 y 1ml mantener el agar licuado
 Motero  Incubadora a 37ºC.
 Balón (2)  Termómetro digital
 Espátula Medios de cultivo
 Gradilla
 Mechero Bunsen  Caldo verde brillante bilis lactosa
 Campanas Durham (19) (BRILLA)
 Agar violeta cristal-rojo neutro-bilis
(VRBA) o agar Endo o Agar Mc Conkey
 Agua Peptonada tamponada
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO

AGUA DE PEPTONA TAMPONADA

USOS:
Se usa como diluyente o para el enriquecimiento

No selectivo de microorganismos en muestras de

Comida y medioambientales.

COMPOSICIÓN:

 Peptona de carne 10,0 g;

 Cloruro de sodio 5,0 g;
 Fosfato disodico 3,5 g;
 Fosfato monopotasico 1,5 g
 El pH final es de 7,0 ± 0,2 a 25°C.
CALDO DE ENRIQUECIMIENTO VERDE BRILLANTE BILIS

LACTOSA – CALDO BRILLA

Es un medio para el enriquecimiento selectivo y
Numeración de gérmenes en aguas, alimentos y otros
Materiales.
COMPOSICIÓN
 Peptona de carne 10,00 g
 Lactosa 10,00 g
 Bilis de buey desecada 20,00 g
 Verde brillante 0,0133 g
 (Fórmula por litro)
 pH final: 7,0 ± 0,2
Solubilidad: 40 g/lValor de pH: 7.2 (40 g/l, H₂O, 30 °C) (tras
Autoclave)

AGAR VIOLETA CRISTAL-ROJO NEUTRO BILIS (VRBA) O AGAR ENDO O AGAR MC CONKEY
VRBA
Es un medio selectivo en placas, que se utiliza para la fase presuntiva para la enumeración de
bacterias coliformes en alimentos y productos lácteos.

COMPOSICIÓN

 Extracto de levadura 3,00 g Violeta cristal 0,002 g

 Peptona 7,00 g Rojo neutro 0.03 g
 Sales biliares 1.50 g Agar 15,00 g
 Lactosa 10,00 g Cloruro sódico 5,00 g
 (Fórmula por litro)
 pH final: 7,0 ± 0,2
Solubilidad: 41,5 g/l de agua destilada disolviendo en vapor de agua por menos de 2 minutos.
(No autoclave)

OPERACIONES PREVIAS
 Preparación de material a usarse en las
pruebas, tubos de ensayo, placas Petri,
pipetas, etc.
 Esterilización de material con calor seco.
 Preparación de medios de cultivo
mencionados según las indicaciones
establecidas en el envase, esterilización de
los mismos según necesidad.
 Preparación de la muestra, pesado y/o
trituración en condiciones asépticas, según sea la necesidad.
 Limpieza y desinfección de las superficies donde se va a trabajar.
PROCEDIMIENTO

I. NÚMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES

A. Preparación y homogeneización de la muestra, de acuerdo al procedimiento recomendado,

consistente en: suspensión inicial y diluciones decimales sucesivas.

B.-
Diluciones en medio de enriquecimiento selectivo: Pipetear 1 ml de c/u de las diluciones del
homogenizado de alimento en tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA) (cada
tubo debe contener una campana de Durhanen forma invertida), utilizando tres tubos por
dilución.

C.-Incubación:
Incubar los tubos de caldo brilla con muestra de 35 a 37ºC por 24 a 48 horas
Anotar los tubos que muestren producción de gas (prueba presuntiva)
NÚMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES
d. De cada tubo que contengan gas, aislar sobre placas agar VRBA o ENDO, Incubar los tubos a
35°C -37°C por 24-48 horas, Colocando las placas invertidas

Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:

–La formación de colonias rojo oscuro con diámetro mayor de 5mm en agar VRBA
–La formación de colonias rojas rodeadas halo en agar ENDO

NUMERACIÓN DE COLIFORMES DE ORIGEN FECAL

Instrumentos
 Asa de inoculación
 Pipetas bacteriológicas de 10 y 1ml
 Mechero Bunsen
 Tubos de ensayo (32)
Equipos
 Contador de colonias
 Baño de agua regulado a 40 °C para mantener el agar licuado
 Incubadora a 37ºC.
Medios de cultivo
 Caldo verde brillante bilis lactosa (BRILLA)
 Reactivo de Kovacs
 Caldo triptosa, volúmenes de 1 ml en tubos de ensayo.
 Agua Peptonada tamponada
PROCEDIMIENTO: NUMERACIÓN DE COLIFORMES DE ORIGEN FECAL

a) Repetir el procedimiento anterior hasta la obtención de los resultados de los tubos con
lado brilla. Páginas 16 al 18.
b) Inocular una azada de cada tubo gas positivo, a un tubo de caldo brilla y a un tubo de
caldo triptosa, incubar los tubos a 44ºC por 24 horas
c) Pasada las 24 horas de incubación, efectuar la prueba de INDOL e los tubos de caldo
triptosa. Prueba del Indol: Al tubo con caldo triptosa, adicionar dos a tres gotas de
reactivo de Kovacspor las paredes. Dejar los tubos en reposo y observar la formación
de un anillo de color rojo para el resultado positivo, o anillo de color amarillo para
resultado negativo.

d) Controlar la formación de gas en los tubos con caldo brilla y la formación de indolen
caldo triptosa, son positivos para coliformes fecales. Para la expresión de resultados
referirse a la tabla de NMP.

 En cada nivel de disolución, inocula 1 ml en cada uno de los 3 tubos de medio

 Para calcular el NMP de las disoluciones mayores que las que se señalan multiplicar el
NMP por el factor de disolución apropiado de 10, 100, 1000, etc. Por ejemplo, si se han
seleccionado tubos provenientes de disoluciones 10-210-310-4multiplicar por 10, si las
disoluciones son de 10-310-410-5multiplicar por 100.
NUMERACIÓN DE COLIFORMES POR EL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA-
PROCEDIMIENTO

a) Preparar la muestra por el procedimiento recomendado para la preparación de

la dilución de la muestra.

b) b) Transferir 1 ml de cada dilución de la muestra a una placa de Petri estéril.

c) c) Adicionar a cada placa Petri, 10 a 15 ml de agar violeta cristal rojo bilis
temperado a 44ºC.
d) Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de vaivén y rotación
a cada placa
e) Distribuir un adicional de agar en la capa solidificada, de tal manera de hacer
doble capa, cubriendo totalmente la primera capa, para inhibir la formación de
colonias en la superficie

f) Invertir e incubar las placas durante 24 horas a 37ºC. Únicamente las colonias
rojo oscuro que misan 0.5mm o más de diámetro en la placa, que tengan entre
20 y 200, colonias, se consideran bacterias coliformes. Si es posible seleccionar
para el recuento solamente aquellas placas no con más de 150 colonias.
Multiplicar el número de colonias por dilución para obtener el número de
bacterias coliformes por gramo de muestra
4. CÁLCULO DE RESULTADOS

a. DETERMINAMOS EL NÚMERO MÁS PROBABLE SEGÚN LOS RESULTADOS OBTENIDOS

EN LA SIGUIENTE TABLA.

i. Identificar los tubos con producción de gas, originario de cada dilución. Marcar positivo
o negativo, según el ejemplo 1.

ii. Indicar el valor para cada dilución, según sea la cantidad de tubos positivos para la
formación de gas.

iii. Contrastar la información obtenida, con la tabla descrita en el anexo 1, determinar el

NMP de coliformes / gr o ml de muestra.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Disolución Repeticiones Valor
+/- +/- +/-

Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3

10-1 + + + 3

10-2 + + + 3
10-3 - + + 2

10-4 + - + 2

10-5 - + - 1

10-6 - + - 1
 Testigo

5. Observación
 Anotar sus observaciones al comparar los cambios ocurridos entre el tubo testigo (a
la cual no se ha agregado muestra, por tanto no sufre cambio alguno) y un tubo
positivo para producción de gas. Indicar las reacciones ocurridas en el proceso.

Observando el tubo testigo la cual es resultado de los restos de la muestras ( a la cual

no se ha agregado muestra, por tanto no sufre cambio alguna) al comparar con los
cambios ocurridos se llega a visualizar un cambio de color de un verde oscuro a un
verde claro variando según número de tubo; comparando con un tubo positivo tambn
se visualiza un cambio a un verde claro, y la presencia de gas.

 Anotar sus observaciones al comparar los cambios ocurridos entre el tubo testigo (a
la cual no se ha agregado muestra, por tanto no sufre cambio alguno) y un tubo
negativo para producción de gas.

De igual forma en un tubo negativo se visualiza el cambio de color, pero en este caso
no se visualiza la presencia de gas en la Campanas Durham.

Interpretación

Según los resultados obtenidos en la tabla del número más probables para la muestra
realizada, elegir tres diluciones consecutivas, llevar los valores a la tabla (anexo 1) para deducir
el resultado.

Diluciones Factor de
Valor 1 Valor 2 Valor 3 dilución NMP/gr
consecutivas

10-1 10-2 10-3 3 3 2 1100 1100

10-4 10-5 10-6 2 1 1 200 20

a. CONFIRMAR LA PRESENCIA DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y FECALES, DE

LAS PLACAS CON SIEMBRA EN AGAR ENDO,
Identificar las colonias según sus características.
 Dilución 10-2

Interpretación

Elemento diferencial del medio VRBA:

• Agar Color Rosa menos intensa

• Colonias rosa incolora que indica un posible indicativo de

Eterobacter aerogenes

 Dilución 10-3

Interpretación

Elemento diferencial del medio VRBA:

• Agar color rosa ligero

• Colonias grandes, claras e incoloras que indicia un posible

indicativo de Salmolla inteiriditis
 Dilución 10-2

Agar endo

 Coloración de colonias rojas

hasta rosados que es un
posible indicativo de
Eterobacters o Klebsiella
  Dilución 10-1

Agar endo

Coloración de cultivo rosa intenso y

colonias rojas con brillos metalicos

Escherichia coli desarrolla colonias

rojas acompañadas de tinción roja del
medio circundante (reacción sulfito
de sodio / fucsina).

6. DISCUSIÓN

Pudimos observar que la muestra y doce tubos presento un tipo de coliforme (fecales y
totales) lo cual nos indica una mala limpieza y desinfección del área de trabajo, la buena
higiene e del manipulador y el almacenamiento que tubo muestra la precisamente este tipo de
contaminación con estos microorganismos.

7. CONCLUSIONES

 Aprendimos a realizar pruebas con método de recuento de número más probable

y que aspectos nos indican que hay presencia de coliformes fecales y totales.

 Pudimos determinar la inocuidad del producto en lo que se refiere a este

indicador.

 Se puso analizar las placas para determinar que microorganismos se encuentran

presentes y poder nombrarlos

 Finalmente se recalcó que es importante la limpieza en todo el procedimiento.

8. BIBLIOGRAFÍA:

 Robert, M. Microorganismos indicadores de la calidad del agua potable en cuba.

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 45, No.1, pp, 32-43, 2014.
  Norma Cubana-ISO 4831: 2010. Método horizontal para la detección y enumeración de
coliformes. Técnica del número más probable.
 Norma Cubana ISO 7218:2013. Microbiología de alimentos de consumo humano y
animal. Requisitos Generales y guía para los exámenes microbiológicos.
 Calidad microbiológica, Coliformes totales,
http://www.calidadmicrobiologica.com/index.php?
option=com_content&task=view&id=6&Itemid=19 (20 de mayo del 2012)

Anexo 1
Tabla 1. El número más probable (NMP) de bacterias, 3 tubos de disolución

Números de tubos positivos en cada nivel de NMP por gr

disolución

-1 -2
0 1
1 0
1 0
1 1
1 2
2 0
2 0
2 1
2 1
2 2
3 0
3 0
3 1
3 1
3 2
3 2
3 2
3 3
3 3
3 3
-3
0 3
0 4
1 7
0 7
0 11
0 9
1 14
0 15
1 20
0 21
0 23
1 40
0 40
1 70
0 90
1 150
2 210
0 200
1 500
2 >1100

En cada nivel de disolución, inocula 1 ml en cada uno de los 3 tubos de medio

Para calcular el NMP de las disoluciones mayores que las que se señalan
multiplicar el NMP por el factor de disolución apropiado de 10, 100, 1000, etc.
Por ejemplo, si se han seleccionado tubos provenientes de disoluciones 10 -2 10-3
10-4 multiplicar por 10, si las disoluciones son de 10 -3 10-4 10-5 multiplicar por
100.

CUESTIONARIO:
1.- ¿POR QUÉ ES IMPORTANTE ESTE INDICADOR MICROBIOLÓGICO
PARA EVALUAR LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE PRODUCTOS
ALIMENTICIOS?

Los alimentos, al igual que el agua, no son, en general, productos estériles. Además de
presentar una baja carga microbiana, determina especies microbianas deben estar
ausentes y determinar la existencia de un patógeno. Este indicador se usa
mayoritariamente en la determinación de contaminación de las aguas.

2. ¿QUÉ IMPORTANCIA TIENE PARA EVALUAR LA CALIDAD

MICROBIOLÓGICA DEL SUELO Y DEL AGUA?

La importancia de la calidad del suelo se define como su capacidad para funcionar

dentro de un ecosistema natural o antrópico; para sostener o mejorar la productividad
animal o vegetal; para mantener y controlar la calidad ambiental, y para soportar la
habitabilidad y salud del hombre.

La importancia de la calidad del agua, es fundamental alimento esencial para los

animales incluido el hombre, frecuentemente actúa como vehículo de transmisión de
microorganismos entéricos

3. ¿QUÉ INDICA LA PRESENCIA DE E. COLI?

La presencia de E. coli puede ser indicativo de la contaminación con otras bacterias,

virus o protozoos que pueden causar enfermedades. Salmonella es una bacteria
comúnmente implicada en alimentos y agua contaminados.

4. UTILIZANDO ¿QUÉ BUENAS PRÁCTICAS DE MANUFACTURA SE PODRÍA EVITAR EL

AUMENTO DEL NMP DE COLIFORMES TOTALES?

Las buenas prácticas de manufactura con capacitación en relación.

 Una frase que describa la identidad del alimento al cual se aplica el criterio.
 Una frase sobre el contaminante de interés, es decir, el microorganismo o
grupo de microorganismos y/o su toxina u otro agente.
 El método analítico que va a utilizarse para la detección, recuento o
cuantificación del contaminante de interés.
  El plan de muestreo.
 Los límites microbiológicos que se consideran apropiados en el alimento y
proporcionales al plan de muestreo que se utilice.

5. INVESTIGAR LA TOLERANCIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES EN ALGUNOS

ALIMENTOS (ALIMENTOS DE SU ELECCIÓN), ESTABLECIDOS EN LA NORMATIVA
NACIONAL.

Los análisis microbiológicos de los productos alimenticios, como así también las demás
prácticas de laboratorio, deben estar respaldados por los datos de pruebas de
seguridad de una calidad, de un rigor de una reproductibilidad suficientes. Los
Principios de Buenas prácticas de laboratorio (BPL) se han elaborado para promover la
calidad y la validez de los datos de análisis que sirven para establecer la inocuidad de
los alimentos. Se trata aquí de un concepto de gestión que abarca la totalidad del
proceso de organización así como las condiciones en las cuales los estudios de
laboratorio se planifican, se aplican, se verifican, se registran y se informan.

La principal bacteria de este grupo es la Escherichia coli cuya presencia en los

alimentos indica una posible contaminación fecal por lo cual el consumidor en caso de
ingerir ese alimento podría estar expuesto a bacterias entéricas. E. coli reúne las
condiciones del indicador ideal de contaminación fecal: está presente universalmente
en las heces y en las aguas residuales, no puede crecer en las aguas naturales y es
fácilmente detectable por métodos rápidos. Muchas cepas de E. coli son causantes de
enfermedad en humanos y animales. La detección de contaminación fecal se debe
realizar de forma rápida y precisa para proteger la salud humana y el medio ambiente
(Paruch, et al., 2012).Los coliformes pueden proliferar en gran cantidad de alimentos,
en agua y productos lácteos. Pueden ser fácilmente destruidos por el calor utilizado en
las diversas etapas de elaboración (Doyle, 2007). Si bien el índice de coliformes ha sido
aplicado a la evaluación de los alimentos durante muchos años, en algunos de ellos
existen limitaciones. En productos lácteos – y otros - no indica contaminación fecal
sino que refleja la higiene general de la planta industrial (Jay, 2002)
 Datos de del experimento

1.- Numero más probable de Coliformes Totales. Lectura en serie de tubos de caldo Brilla.

Muestra Diluciones y tubos gas positivos Coliformes Total

NMP/ gr o ml

1.- Lechuga Fresca 10-1 10-2 10-3

21
2+ 2+ 1+

2.- Tomate 10-1 10-2 10-3

90
3+ 2+ 0

3.- Harina de maíz 10-2 10-3 10-4

7
1+ 1+ 0

4.- Queso fresco 10-1 10-2 10-3

1100
3+ 3+ 2+

5.- Leche fresca 10-3 10-4 10-5

15
2+ 1+ 0

6.- Carne de pollo 10-1 10-2 10-3

cruda 500
3+ 3+ 1+

7.- Carne cuy 10-3 10-4 10-5

7
1+ 0 1+

8.- Carne de res 10-1 10-2 10-3

150
3+ 2+ 1+

9.- Sandwich de 10-2 10-3 10-4

hamburguesa 21
2+ 2+ 0

10.- Hojas de 10-2 10-3 10-4 9

Orégano
2+ 0 0
11.- Ají seco 10-2 10-3 10-4
200
3+ 3+ 0

12.- Paprika seca 10-2 10-3 10-4

1100
3+ 2+ 2+

13.- Refresco de maíz 10-2 10-3 10-4

morado 15
2+ 1+ 0

14.- Salchichas de 10-3 10-4 10-5

pollo 3
0 1+ 0

15.- Filete de Pescado 10-3 10-4 10-5

23
3+ 0 0
 2.- Numero más probable de Coliformes Fecales. Lectura en serie de tubos de caldo Brilla.

Prueba confirmativa

Muestra Diluciones y tubos gas positivos NMP/ gr o ml

E. Coli
Indol Kovacs
+ ó -

1.- Lechuga Fresca 10-1 10-2 10-3 20 Rojo +

2+ 1+ 1+
2.- Tomate 10-1 10-2 10-3 90 Amarillo -
3+ 2+ 0
-2 -3
3.- Harina de maíz 10 10 10-4 7 Amarillo -
1+ 1+ 0
-1 -2
4.- Queso fresco 10 10 10-3 1100 Rojo +
3+ 3+ 2+
5.- Leche fresca 10-3 10-4 10-5 15 Rojo +
2+ 1+ 0
6.- Carne de pollo 10-1 10-2 10-3 500 Rojo +
cruda
3+ 3+ 1+
-3 -4
7.- Carne cuy 10 10 10-5 7 Rojo +
1+ 0 1+

8.- Carne de res 10-1 10-2 10-3 150 Rojo +

3+ 2+ 1+

9.- Sandwich de 10-2 10-3 10-4 21 Amarillo -

hamburguesa
2+ 2+ 0

10.- Hojas de 10-2 10-3 10-4 9 Amarillo -

Orégano
2+ 0 0

11.- Ají seco 10-2 10-3 10-4 200 Rojo +

3+ 3+ 0

12.- Paprika seca 10-2 10-3 10-4 1100 Rojo +

3+ 2+ 2+

13.- Refresco de maíz 10-2 10-3 10-4 15 Amarillo -

morado
2+ 1+ 0
14.- Salchichas de 10-3 10-4 10-5 3 Rojo +
pollo
0 1+ 0

15.- Filete de 10-3 10-4 10-5 200 Rojo +

Pescado
3+ 0 0
 3.- Numeración de Coliformes por el método de recuento en placa (por duplicado)

Muestra Dilución Método conteo Placa Recuento Ufc/ml Promedio

Ufc/ ml
1.- Queso fresco 10-3 ¼ placa 1 50*4=200 200 220000
¼ placa 2 60*4=240 240 22x104
2.- Carne de pollo 10-2 ½ placa 1 43*2=86 86 9400
½ placa 2 51*2=102 102 94x102
3.- Leche fresca 10-3 Placa entera 1 122 122 128000
Placa entera 2 134 134 12x104
4.- Zumo de 10-1 ½ placa 1 76*2=152 152 1580
naranja ½ placa 2 82*2=164 164 15x102
5.- Salsa soya 10-2 ½ placa 1 34*2=68 68 7900
½ placa 2 45*2=90 90 79x102
6.- Arroz 10-2 ¼ placa 1 163*4=652 652 61600
¼ placa 2 145*4=580 580 61x103
7.- Carne de res 10-4 Placa entera 1 32 32 440000
cruda Placa entera 2 12 12 44x104
8.- Mayonesa 10-4 ¼ placa 1 56*4=224 224 2680000
¼ placa 2 78*4=312 312 26x105
9.- Refresco 103 ¼ placa 1 32*4=128 128 84000
Limonada ¼ placa 2 10*4=40 40 84x103
10.Chocolate 10-2 ½ placa 1 23*2=46 46 4100
½ placa 2 18*2=36 36 41x102
11. Turrón de doña 10-3 Placa entera 1 36 36 42000
pepa Placa entera 2 48 48 42x103
12.- Ensalada de 10-3 ¼ placa 1 23*4=92 92 108000
lechuga ¼ placa 2 31*4=124 124 10x104