SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE MANIPULADORES

1. OBJETIVO

Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar la evaluación
microbiológica de manos y garganta, tomadas en manipuladores de alimentos.

2. ALCANCE

Este procedimiento es aplicable para el análisis de frotis de manos y garganta tomadas en

manipuladores involucrados en procesos de producción de alimentos, cosméticos, medicamentos,
analistas de laboratorio, etc.

3. DEFINICIONES

DESINFECCIÓN: Proceso de inactivación, destrucción o remoción de la carga bacteriana presente

sobre una superficie. La desinfección no implica necesariamente esterilización.

ESTERILIZACIÓN: Proceso en la cual se elimina completamente toda forma de vida microbiana.

HIGIENE: La higiene es el conjunto de conocimientos y técnicas que aplican los individuos para el
control de los factores que ejercen o pueden ejercer efectos nocivos sobre su salud.

LIMPIEZA: La limpieza se define como el proceso de remover, a través de medios mecánicos y/o
físicos, el polvo, la grasa y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales, personal, etc.
Este proceso, junto con un adecuado proceso de desinfección, es indispensable para controlar la
presencia de los microorganismos en el ambiente.

SANITIZACIÓN: Proceso empleado para reducir el contenido de microorganismos viables en una

superficie limpia.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES

4.1. FUNDAMENTO

Se basa en el aislamiento de microorganismos indicadores de contaminación que pueden ser

transmitidos al producto durante el proceso de elaboración, fabricación, empaque, almacenamiento
y/o distribución. Cada una de las células aisladas dará lugar a una Unidad formadora de colonia.

Página 1 de 5
La evaluación microbiológica de manipuladores de alimentos es un método de ensayo que se emplea
con el fin detectar prácticas higiénicas inadecuadas de los manipuladores, a través del estudio
microbiológico de frotis tomados directamente a partir de manos y garganta.

4.2. INTERFERENCIAS

 Contaminación cruzada en el transporte, recepción y almacenamiento de las muestras.

 Dilución de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.
 Inadecuada homogeneización.
 Temperatura de incubación fuera del rango de especificación para el analito.

4.3. TOMA Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS

Recolectar las muestras con la ayuda de hisopos estériles (Escobillones) en manos y garganta.
Luego introducir los hisopos en tubos con 5 ml de caldo BHI. Conservar a temperatura entre 2 y 6 °C
y transportar de inmediato al laboratorio para realizar los respectivos análisis.

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.

4.4.1. Equipos.

 Cabina de flujo laminar.

 Cuenta colonias.
 Incubadora 35 °C.
 Neveras.

4.4.2. Materiales.

 Asa de Hokey.
 Bandejas de transporte.
 Cajas Petri grandes.
 Dispensador de pipetas.
 Frascos y recipientes para descarte.
 Gradillas.
 Hisopos estériles.
 Marcadores.
 Micropipetas de 100 y 1000 µL.
 Pipetas graduadas estériles de 1, 5 y 10 mL.
 Tips para micropipetas, azules y amarillas.
 Toallas de papel absorbente.
 Tubos de ensayos tapa rosca 16 cm x 16 mm.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos.

 Agar Baird Parker.

 Agar M-FC.
 Caldo BHI.
 Plasma de conejo.
Página 2 de 5
4.4.3.1. Indicaciones para la preparación del Agar Baird Parker

 Agregar 63 g del polvo en 1000 mL de agua desionizada.

 Someter el medio a calor hasta disolver completamente.
 Ajustar el pH a 7.0 +/- 0,2.
 Esterilizar en autoclave a 121º C, 15 PSI, durante 15 minutos.
 Dejar enfriar aproximadamente a 45º C y adicionar por cada 200 mL de agar base Baird
Parker; 10 mL de solución yema de huevo al 20% y 0.6 mL de Telurito de Potasio 3.5 %.
 Agitar suavemente hasta mezclar completamente el agar con los agregados. Servir en cajas
petri grandes estériles.
 Dejar solidificar y almacenar entre 2 y 6 °C.
 Eliminar el exceso de humedad sobre la superficie de la caja, exponiendo la caja abierta en la
cabina de flujo laminar, durante unos minutos.

4.4.3.2. Indicaciones para la preparación del caldo BHI.

 Agregar 37,63 g del polvo en 1 L de agua destilada.

 Agitar hasta disolver completamente.
 Ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
 Dispensar de 5 a 7 ml del caldo en tubos de ensayo taparrosca.
 Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
 Retirar los tubos de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.

4.4.4. Soluciones.

 Cloruro de Sodio 0,85 %.

 Alcohol Etílico 96 %.
 Solución yema de huevo.
 Solución Telurito de Potasio.

4.4.4.1. Indicaciones para la preparación de la solución de yema de huevo al 20%.

 Lavar los huevos con abundante agua y jabón.

 Sumergir los huevos en una solución de alcohol al 70% durante 15 minutos.
 Perforar la corteza del huevo en la parte superior con ayuda de una pinza estéril.
 Dejar salir la albúmina (clara del huevo) cuidadosamente hasta quedar solo la yema.
 Añadir 20 mL de yema de huevo en una probeta estéril con capacidad de 100 mL. Completar
un volumen de 100 mL, añadiendo 80 mL de solución salina 0.85% estéril.
 Agregar en un frasco estéril y rotular adecuadamente con la fecha y nombre de la preparación.
 Agitar vigorosamente para homogeneizar completamente.

Nota: Conservar entre 2 a 6 °C y descartar 8 días después de la preparación o cuando se observe

algún signo de contaminación.

4.4.4.2. Indicaciones para la preparación de la solución Telurito de Potasio 3.5%.

 Pesar 3.5 g de Telurito de Potasio (K2TeO3), en papel parafinado.

 Llevar a un vaso de precipitado y agregar una pequeña cantidad de agua destilada estéril,
para disolver.

Página 3 de 5
  Transferir esta solución a un balón aforado de 100 mL y aforar con agua destilada estéril.
 Almacenar en un frasco estéril, e identificar adecuadamente con el nombre y fecha de la
preparación.
 Conservar entre 2 y 6 °C.

NOTA: En caso de disponer de una solución comercial de Telurito de Potasio al 3.5 %, tomar
directamente del frasco; el volumen necesario y almacenar según las indicaciones del fabricante.

4.5. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

 Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección.

 Lavarse las manos antes y después de manipular.
 Desinfectar el área de trabajo antes y después de realizar una tarea.
 No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo.
 No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de cultivos,
reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
 Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lámparas UV. No ingresar al
área mientras se encuentre encendida.
 Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.6. PROCEDIMIENTO

4.6.1. Método con hisopo estéril.

 Frotar con un escobillón estéril, la palma, alrededor de las uñas, las áreas interdactilares de
las manos del manipulador a evaluar, introducir el hisopo en un tubo con 5 mL de caldo BHI.
 Tomar los tubos que contienen el escobillón con la muestra del manipulador a evaluar, dejar
temperar y con la ayuda del hisopo contenido en el mismo; realizar una siembra masiva
sobre las placas con Agar M-FC y Agar Baird Parker.
 Realizar los controles de calidad.
 Invertir e incubar las cajas de Agar M-FC a 44.5 ± 0,5 °C durante 24 horas y las placas de
Agar Baird Parker a 35 ± 2 °C durante 48 horas.
 Luego de transcurrir el tiempo de incubación, retirar las cajas de la incubadora y realizar la
lectura de las colonias.

4.6.2. Método impresión dactilar.

 Destapar las cajas, e indicar al manipulador colocar los dedos de las manos sobre la superficie
del agar (Cajas con Agar M-FC y Agar Baird Parker) para el aislamiento de los
microorganismos, de modo que queden impresas en el medio.
 Rotular las cajas petri con la fecha, hora y código de la muestra.
 Invertir e incubar las cajas de Agar M-FC a 44.5 ± 0,5 °C durante 24 horas y las placas de
Agar Baird Parker a 35 ± 2 °C durante 48 horas.
 Realizar los controles de calidad.

4.6.3. Cálculos.

Página 4 de 5
Coliformes termotolerantes: Realizar el recuento de las colonias de coliformes termotolerantes en las
cajas con agar M-FC (Colonias azules de distintos tonos), reportar el resultado como
Ausencia/Presencia Coliformes termotolerantes.

Staphylococcus aureus: Realizar el recuento de las colonias de Staphylococcus aureus en las cajas
con agar Baird Parker (Colonias negras y brillantes, lisas, convexas, de 2 a 3 mm de diámetro, con
bordes reducidos blancos, rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco y zona de
precipitado). Luego realizar la prueba de la coagulasa como se indica a continuación:

4.6.3.1. Prueba de la coagulasa.

 Transferir por separado cada una de las colonias presuntivas a tubos que contengan 5 mL de
caldo BHI.
 Incubar a 35 +/- 2 °C durante 18 a 24 horas.
 Transferir 0.3 mL de cada cultivo de BHI, a tubos estériles con 0,3 mL de plasma de conejo
reconstituido (Reconstituir según indicaciones del fabricante).
 Incubar a 35 +/- 2 °C y observar cada hora y durante 6 horas; la formación de un coagulo de
fibrina bien definido al inclinar los tubos. Asumir la prueba negativa si no se observa
formación de coágulo después de 24 horas de incubación.

Reportar el resultado como Ausencia/Presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. En

caso de no observar crecimiento o encontrar reacción negativa en la prueba coagulasa; reportar
Staphylococcus aureus coagulasa positiva “Ausente”.

4.7. BIBLIOGRAFÍA.

 NTC 5230

 Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA Santa Fe de Bogotá, 1998.

Página 5 de 5