SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

ANALISIS PARA LA DETERMINACION DEL GRUPO COLIFORMES RECUENTO EN PLACA

1. INTRODUCCION Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli.

La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.

2. OBJETIVOS Comprender y realizar adecuadamente la determinacin de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placas vertidas. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables. Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales. Detectar si la muestra trada es apta para el consumo humano. Organizar e interpretar los resultados.

3. MATERIAL Y EQUIPO Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con termmetro calibrado. a Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrculada y lente amplificador. b Registrador mecnico o electrnico b Microscopio ptico b Bao de agua con termmetro calibrado, que mantenga la temperatura a 45 1.0 C. a Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a Propipetaa Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (Las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones). a Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior. (Las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a Pipetas Pasteur estriles a, b 4 a 8 cajas Petri estriles, de 15 x 100 mm. a Stomacher (homogeneizador peristltico). a Bolsas estriles para stomacher. a NOTAS
a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 24 y 48 h. de iniciada la prctica.

3.1 MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES COLIFORMES EN PLACA 1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a 2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a 5 a 9 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL. a

3.2 SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Frascos gotero con reactivo de Ehrlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e COLORANTES PARA TINCIN DE GRAM

4. PROCEDIMIENTO

4.1 TCNICA PARA PREPARAR DILUCIONES. 1.- Tomar 10 g del alimento. Pasarlo junto a 90 ml de caldo de triptona (solucin isotnica) o agua destilada en una bolsa de stomacher. Homogeneizar el conjunto en el Stomacher. El resultado es una dilucin 1:10. 2.- Tomar 1 ml. de la dilucin 1:10 y pasarlo a un tubo al que previamente se le ha aadido 9 ml. de caldo o agua destilada. Homogeneizar la solucin en un agitador de tubos. La dilucin que hay ahora en este tubo es 1:100 3.- De manera anloga podramos conseguir las diluciones 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000 etc

Nota: Todos los tubos se marcarn con rotulador segn la dilucin que posean.

4.2 DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN PLACA Vamos a seguir el mismo mtodo para la determinacin de los dos tipos de Coliformes, lo nico que variar ser la temperatura de incubacin de cada determinacin, que para los Coliformes Totales ser de 37 C y para los fecales ha de ser de 44 C. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Recordar que el rango de sensibilidad del mtodo es de 15 a 150 colonias por placa. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inculo. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y mantenido a 45 1.0C en bao de agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio, mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fra. No permitir que se mojen las tapas de las cajas.

En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 5 mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 C, no permitir que se mojen las tapas de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el crecimiento de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la esterilidad. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 37C, durante 24 2 h. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0.5 a 2.0 mm. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en el inciso de RESULTADOS de la prctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeas partculas de alimento.

Procedimiento E. coli Enriquecimiento Pesar 65 g 2 g de la muestra, colocar en una bolsa de Stomacher, agregar 585 ml 11.7 ml de caldo TSBm+n y homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher. Incubar a 42 C 1C durante 15 h a 22 h. Incluir un control positivo, otro negativo y un medio sin inocular como controles para cada grupo de muestras analizadas.

Nota: En el caso de carne de vaca cruda molida, y carne de vaca cruda molida mezclada con pollo o cerdo, pasteles o empanadas rellenos con carne cocidos, y recortes de carne, se pueden combinar 5 muestras de 65 g para obtener una muestra compuesta (pool) de 325 g 32.5 g. Llevar a dilucin 1:4 con 975 ml 19.5 ml de caldo TSBm+n y homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la prctica Cuenta de Bacterias en Placa. Reportar como se indica a continuacin, con dos cifras significativas y potencias de 10. Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 + 2 h a 35 C: _____ UFC / g (o / mL) de muestra.

BIBLIOGRAFA

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