PROTOCOLO DE VALIDACION DE PRUEBA DE RECUENTO MICROBIANO EN GELES.

1. OBJETIVO

2. ALCANCE

3. RESPONSABILIDADES

4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR

5. METODOLOGA DE VALIDACIN
1. OBJETIVO:

Demostrar mediante evidencia documentada que la metodologa para evaluar la recuento

microbiano en geles, est totalmente bajo control y proporciona de forma consistente y
reproducible resultados que cumplen las especificaciones establecidas.

2. ALCANCE:

Este protocolo se utilizar para la validacin de recuento microbiano en gels oftlmicos, tales
como xxxx

3. RESPONSABILIDAD:

3.1. Analista de Microbiologa, es responsable de Disear, planificar, desarrollar, registrar datos y

de preparar el reporte de validacin, adjuntando toda la documentacin pertinente.
3.2. Jefe de Control de Calidad, es responsable de vigilar la correcta ejecucin de la validacin
3.3. Jefe de Validaciones, es el responsable de mantener vigente la calificacin de los equipos y
calibracin de los instrumentos de medicin utilizados en la validacin.
3.4. Jefe de Aseguramiento de la Calidad es el encargado de la coordinacin de las actividades
que genere la validacin, as como de colaborar en la revisin de la documentacin propia
del proceso de validacin.
3.5. El Director Tcnico es responsable de la aprobacin del Reporte Final de la Validacin y de
darlo a conocer a los involucrados.
4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR

4.1. Equipos

FECHA
NOMBRE MARCA CDIGO
CALIBRACIN
Cabina de bioseguridad
Balanza de precisin
Estufa de Incubacin 30-35C
Autoclave
Refrigeradora de 2-8C
Espectrofotmetro

4.2. Materiales de vidrio y accesorios

FECHA
NOMBRE MARCA CDIGO
CALIBRACIN
Frascos x 100 mL con tapa
Frasco x 250 Ml con tapa
Pipeteador variable (1-10mL)
Placa Petri descartable 90x15mm

4.3. Material de referencia, producto y activos

FECHA
NOMBRE MARCA LOTE/PROTOCOLO
VENCIMIENTO
Escherichia coli ATCC 8739
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

4.4. Medios de Cultivo, reactivos y excipientes

FECHA
NOMBRE MARCA LOTE
VENCIMIENTO
Agar CASO
Agar Sabouraud
Polisorbato 80
5. METODOLOGA DE VALIDACIN:

5.1. Consideraciones Generales

Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este
procedimiento.

5.2. Referencias:

Validacin de Mtodos Analticos AEFI 2001: Adaptado de Grado de contaminacin

microbiana - Recuperacin microbiana. Pag. 170
USP 39: Adaptado de <51> Prueba de recuento microbiano. Pag. 119-122.

5.3. Preparacin de la suspensin microbiana

5.3.1.Usar microorganismo subcultivados de cepas de referencia. Los microorganismos de

prueba deben corresponder a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra
maestro original, y formar parte de un cultivo de crecimiento reciente. Cultivar por
separado cada cepa bacteriana y fngica de prueba (ver la Tabla N1).

Tabla N1: Condiciones de Cultivo para la Preparacin de lculos

Tiempo de
Temperatura Tiempo de Incubacin
Organismo Medio Apropiado de Incubacin de
Incubacin del inculo Recuperacin
Microbiana
Escherichia coli
32,5 2,5 18-24 horas 3-5 das
(ATCC N 8739) Agar CASO
Pseudomonas
aeruginosa 32,5 2,5 18-24 horas 3-5 das
(ATCC N 9027) Agar CASO
Staphylococcus aureus
32,5 2,5 18-24 horas 3-5 das
(ATCC N 6538) Agar CASO
Candida albicans
Agar Sabouraud 22,5 2,5 44-52 horas 3-5 das
(ATCC N 10231) Dextrosa
Aspergillus brasiliensis
Agar Sabouraud 22,5 2,5 6-10 das 3-7 das
(ATCC N 16404) Dextrosa

5.3.2.Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solucin salina SR

estril, lavar la superficie de crecimiento y recogerlo en un recipiente adecuado. Para
cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solucin salina SR estril que contenga
0,05% de polisorbato 80. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las
24 horas si se almacenan a una temperatura entre 2 y 8.

5.1. Promocin de Crecimiento

 Los medios usados en esta validacin deben ser capaces de permitir el crecimiento
microbiano. Analizar cada lote de medio a usar, segn procedimiento P-CCM-004
PROMOCION DE CRECIMIENTO Y CONTROL NEGATIVO DE MEDIOS DE CULTIVO

5.2. Preparacin de la muestra

Disolver aproximadamente 10 g del producto a examinar en 90 mL de Solucin Amortiguada

de Fosfato de pH 7,2 atemperado entre 40 45C. Agitar para dispersar el producto.

5.3.3.Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustarse para
obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 10 8 ufc/ml. Usar las
suspensiones bacterianas y de levaduras dentro de las 2 horas o dentro de las 24
horas, si se almacenan entre 2 y 8. Se puede preparar una suspensin de esporas
estable y mantenerla a 2-8 hasta 7 das.

5.3.4.El clculo estimado de la concentracin del inculo se puede obtener mediante

procedimientos turbidimtricos para los microorganismos de desafo y luego
confirmarse mediante un recuento en placa.

5.3. Prueba de Aptitud del Mtodo

Preparar una dilucin 10-1 (en volumen) agregando 1 g del producto a 9 mL de Caldo CASO
con polisorbato 80 al 2%. Continuar este patrn de dilucin hasta niveles de dilucin 10 -2 y
10-3. Agregar un nmero apropiado de organismos de desafo a cada tubo de producto
diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilucin para obtener
(idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realizarse como mnimo por
duplicado. Se realiza un control positivo de este procedimiento al introducir los mismos
inculos en solucin salina y transferir volmenes similares de solucin salina a placas de
agar. Un patrn de recuperacin adecuado es aqul que proporciona al menos 50% del
recuento de esta solucin salina de control (promediado). Para el recuento usar los medios
indicados en la tabla N1.

5.2 Promocin de crecimiento:

Prepara diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 a partir de una suspensin microbiana que tiene una
transmitancia de 25% de la(s) cepa(s) indicadas en la tabla N1.

Si el medio es slido usado para determinacin de microorganismo especfico, esparcir con

ayuda de una esptula estril un volumen medido de 0,1 ml de las diluciones 10-3 y 10-4 de
los microorganismos adecuados sobre la superficie del medio. Incubar a la temperatura y
tiempo especificado en la tabla N1. Se produce un crecimiento de microorganismos
comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada
previamente.

5.4. Anlisis del producto

5.4.1.En cada uno de cinco frascos de 100 mL de vidrio estriles con tapa, transferir 10 g de
producto de manera asptica.
5.4.2.Calentar la muestra entre 45 C hasta 50 C hasta que se haga ms fluida, aadir la
suspensin microbiana despus de bajar la temperatura y dispersar el inculo
uniformemente con una varilla de vidrio estril o esptula. Cada envase debe contener
uno de los microorganismos indicados en la tabla N1.
5.4.3.El volumen de suspensin del inculo empleado est entre 0,5% y 1,0% del volumen
del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentracin de
microorganismos de prueba agregados al producto es tal que la concentracin final de
 la preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 x 10 5 y 1
x 106 ufc/g del producto. Esto se puede conseguir agregando 50 L de un inculo de
1x108 ufc/mL a 10 g de producto.
5.4.4.Incubar estos recipientes entre 20 C y 25 C y calcular los recuentos de clulas
viables a los 0, 7, 14 y 28 das. Anote cualquier cambio marcado, como cambios en el
color o el aspecto de un mal olor, cuando se observa en las muestras mezcladas
durante este tiempo.
5.4.5. La concentracin inicial de microorganismos viables en cada preparacin de prueba se
calcula a partir de la suspensin microbiana mediante el mtodo de recuento en placa.
5.4.6.Preparar la muestra para el recuento microbiano, disolviendo 1g del producto a
examinar en 9 mL de Caldo CASO con polisorbato 80 al 2% estril (10-1) mantenido a
no ms de 45C. Mezclar cuidadosamente. Realizar diluciones 10-2 y 10-3 en tubos con
9 ml de solucin de peptona al 0.1 % con polisorbato 80 al 2%, estril.
5.4.7.Agregar a placa Petri estril 1 mL de cada dilucin, luego vertir 15 a 20 mL de Agar
Digerido de Casena y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, segn microorganismo
evaluado (ver tabla N1) manteniendo la temperatura de ambos medios a no ms de
45C. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo.
5.4.8.Para el caso de bacterias incubar las placas de 30-35C por no ms de 3 das. Para
hongos y levaduras incubar las placas 20-25C por no ms de 5 das. Tomar la media
aritmtica de los recuentos obtenidos en cada medio y calcular el nmero de ufc
multiplicando por su factor de dilucin.

5.5. Interpretacin y Criterio de aceptacin:

5.5.1.Para la presente validacin se va considerar a los geles oftlmicos dentro de la

Categora 1 de productos farmacopeicos (USP 39, Pruebas Microbiolgicas/ <51 >
Pruebas de Recuento microbiano, pp 121), por lo que se aplica el siguiente criterio:

5.5.1.1. Bacterias: A los 7 das, una reduccin logartmica de no menos de 1,0 desde
el recuento inicial calculado; a los 14 das, una reduccin logartmica de no menos
de 3,0 del recuento inicial; y a los 28 das ningn incremento con respecto al
recuento de los 14 das.
5.5.1.2. Levaduras y hongos filamentosos: Ningn incremento a los 7, 14 y 28 das
con respecto al recuento inicial.

5.5.2.Lotes a ensayar:
a) 3 lotes de producto con diferentes lotes de materia prima a usar como conservante
b) De preferencia usar lotes de producto prximo a su caducidad
c) 1 lote piloto (placebo), sin adicin de conservantes. Permite evaluar si la
formulacin del producto sin conservante tiene propiedad antimicrobiana. En este
caso es posible que no se necesite adicionar conservantes.

5.5.3.Aceptacin:
Al efectuar el ensayo con los 3 lotes de producto pueden obtenerse los siguientes
resultados:
a) Lote 1 Cumple criterio de aceptacin
Lote 2 Cumple criterio de aceptacin
Lote 3 Cumple criterio de aceptacin

El producto cumple con la prueba de recuento microbiano de conservantes.

b) Lote 1 Cumple criterio de aceptacin

Lote 2 Cumple criterio de aceptacin
Lote 3 No cumple criterio de aceptacin

Debe repetirse el ensayo con 3 lotes ms de producto para decidir si cumple con la
prueba. Tambin debe investigarse las causas de las discrepancias (lote de materia
prima diferente, impurezas, productos de degradacin, etc)
c) Lote 1 No / o Cumple criterio de aceptacin
Lote 2 No cumple criterio de aceptacin
Lote 3 No cumple criterio de aceptacin

No cumple con la prueba de validacin. Se debe investigar las causas del no

cumplimiento. Evaluar la modificacin de la frmula del producto.