CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTERIAS Y

BACILOS

Lopez Vivian Yulieth, Muñoz Maria Camila, Orozco Daniela

Escuela de ingeniería de alimentos

Cali, Valle

Resumen

En esta práctica se realizaron pruebas bioquímicas para identificar el metabolismo de una

muestra de una enterobacteria y un bacilo. Para ello a la enterobacteria Klebsiella

pneumoniae, se le hicieron pruebas de Citrato de Simmons, voges-proskauer (MRVP),

reacción de etilo (MRVP), Urea de Christensen, Lisina decarboxilasa, agar Mc Conkey, TSI,

motilidad, prueba de indol y formación de sulfuro de hidrógeno (H2S) obteniendo como

resultado positivo para las primeras siete y por consiguiente negativas las restantes.

Seguidamente, al bacilo Bacillus cereus se le hicieron pruebas de agar de gelatina, agar

almidón, caldo glucosa, caldo xilosa, caldo arabinosa y caldo nitrato, obteniendo como

resultado positivo para las tres primeras y negativo las siguientes.

Palabras clave: Pruebas bioquímicas, Enterobacterias, Bacilos. Klebsiella pneumoniae, Bacillus

cereus.

1. Introducción

Tanto en crecimiento como en reposo, las células dependen de la constante aporte de energía.

La célula viva constituye un estado altamente ordenado de la materia. No solo se requiere

energía para conseguir este orden sino también para mantenerlo. La energía necesaria para

mantener este estado vivo, así como para sintetizar los componentes celulares, la obtiene el

organismo mediante el metabolismo, es decir por medio de la transformación controlada en el

interior de la célula de los distintos compuestos. Las fuentes de energía están constituidas por

1
las sustancias nutritivas que se toman del medio. Estas sustancias son transformadas en el

interior de la célula mediante una serie de reacciones enzimáticas consecutivas que forman

parte de vías metabólicas específicas de cada especie. (1)

Partiendo de estas características metabólicas específicas, se realizan pruebas para la

identificación de microorganismos y productos obtenidos de la relación

microorganismo-medio, a partir de estas se detecta la posible contaminación de los alimentos

por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímicas han proporcionado

una herramienta útil para la detección directa de los microorganismos contaminantes. La

identificación bacteriana se puede realizar por medio de una serie de análisis que necesitan de

diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies bacterianas que

contaminan los alimentos o las aguas.

Las pruebas bioquímicas entonces, ayudan a determinar características metabólicas de

bacterias. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas y otras, en su mayoría, requieren

para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h. Sin

embargo, algunas de estas se pueden realizar tras incubación de unas 2-6h. En el presente

artículo se desarrollan diferentes técnicas para la identificación de algunos microorganismos

y productos obtenidos en la relación ya mencionada, microorganismo-medio.(2)

2. Objetivos

2.1. Objetivo general

2.1.1. Realizar y analizar las diferentes técnicas de identificación bacteriana.

2.2. Objetivos específicos

2.2.1. Caracterizar en cada medio de cultivo el fundamento de la técnica

empleada.

2
 2.2.2. Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una

previa interpretación.

3. Materiales y métodos

3.1. Caracterización bioquímica de Enterobacterias: Klebsiella pneumoniae

Inicialmente se realizan pruebas de Citrato de Simmons, voges-proskauer

(MRVP), reacción de etilo (MRVP), Urea de Christensen, Lisina

decarboxilasa, agar Mc Conkey, TSI, motilidad, prueba de indol y formación

de sulfuro de hidrógeno (H2S). Para ello se toma el asa recta, se esteriliza y se

toma una muestra de la bacteria y se siembra en el centro y por profundidad en

el medio SIM para la prueba de movilidad, se flamea y tapa el tubo. Después

de la incubación a las 24 horas adiciones 0,1 mL de reactivo de Kovacs a los

tubos con este medio.

Seguidamente se toman dos tubos con caldo con MRVP y se realiza la siembra

en cada uno tomando el asa circular, se esteriliza, se toma muestra de la

bacteria se introduce en el tubo y se agita. Luego de incubar por 24- 48 horas,

a uno de los tubos se adicionan 5 gotas de la solución rojo de metilo mientras

que al otro se adiciona 5 mL de la solución de sulfato de cobre y se deja

reposar por 30 minutos.

Para la prueba de citrato, se toma el asa, se esteriliza y se siembra en la

superficie del mismo en zig-zag. Del mismo modo se realiza la siembra para la

prueba de urea, es decir, en superficie con estria. Para la prueba de TSI y

Lisina se realiza la siembra tomando el asa recta esterilizando y sembrando de

forma recta introduciendola hasta fondo del tubo y finalmente también en la

3
 superficie. En el caso del agar MacConkey la siembra se realiza por

agotamiento haciendo rayados suaves en forma de zig-zag.

3.2. Caracterización bioquímica de bacilo: Bacillus cereus

Para este punto, se toma una muestra de la caja de Petri que contiene el cultivo

bacteriano y se siembra con un asa una muestra de cada uno de los tubos que

contienen agar almidón, agar gelatina, caldo nitrato, caldo glucosa, caldo

arabinosa, caldo xilosa. Se incuba a 37°C por 24 horas. Para la siembra, en el

caso del agar almidón y gelatina, se realiza con el asa esterilizada y en línea

recta. Para las pruebas restantes se realiza la siembra con el asa circular,

esterilizada y agitando la muestra tomada dentro de cada tubo.

Al día siguiente lea las pruebas bioquímicas de la siguiente manera:

Agar almidón: Se cubre la superficie del tubo con solución de lugol; si se ha

producido la hidrólisis de almidón, se tiñe de azul. Las áreas hidrolizadas,

aparecen como zonas claras.

Agar gelatina: Se añade al tubo 5 gotas de cloruro de mercurio al 15%, se

elimina después de 5 minutos, se lava el tubo con agua corriente. La reacción

es positiva cuando una zona clara rodea la estría.

Caldo glucosa, arabinosa y xilosa: Se observa si hubo o no fermentación

indicada por un color rosado en el medio de cultivo y si hubo o no producción

de gas, indicada por la aparición de burbujas en el caldo.

Glucosa + sin gas

4
 Arabinosa –

Xilosa –

Caldo nitrito: Se añade al tubo unos miligramos de reactivo de Griess y se

observa el color que presenta. El color rojo representa prueba positiva de

reducción de nitratos. Si no hay cambios de color representa una prueba

negativa.

4. Resultados y discusión

4.1. Caracterización bioquímica de enterobacterias: Klebsiella pneumoniae

4.1.1. Prueba de Citrato de Simmons

Debido a que en este medio de cultivo la única fuente de nitrógeno es

el fosfato monoamónico y la única fuente de carbono es el citrato de

sodio; lo convierte en un medio diferencial, siendo los

microorganismos capaces de crecer con estas únicas fuentes de

carbono y nitrógeno, produciendo en consecuencia alcalinidad en el

medio, y por la presencia de azul de bromotimol, un indicador de pH,

el medio cambia a color azul. En la Figura 1 se puede observar el

cambio de color en la prueba de Citrato antes y después de la

incubación, el cual cambió de color verde (Figura 1.a) a un color azul

(Figura 1.b), indicando que la bacteria utilizada (Klebsiella

pneumoniae) produce citrato permeasa, enzima necesaria para el

desdoblamiento del citrato de sodio,Resultados similares se pueden

observar en el control de calidad realizado por BRITANIA.

5
 (a) (b)

Figura 1. Prueba de Citrato antes (a) y después (b) de la incubación

4.1.2. Prueba de motilidad e indol (medio SIM)

Por sus siglas, esta prueba hace referencia a la producción de sulfuro

de hidrógeno (S), formación de indol (I) y motilidad (M),

considerándose por lo anterior un medio diferencial, como fuente

principal de energía posee peptonas y tripteína, la formación de sulfuro

de hidrógeno (H2S) a partir de tiosulfato de sodio, se distingue por un

precipitado negro de sulfuro ferroso; por otro lado, la formación de

indol, surge en consecuencia de la acción de la enzima triptofanasa

sobre el aminoácido triptófano, esta es una sustancia incolora, por esto

es necesario la adición de una sustancia reveladora como reactivo de

Kovac’s, que se traduce en positiva con la aparición de un anillo rojo

en la superficie del agar, debido a la reacción del reactivo con el indol

presente; por último, gracias a que este es un medio semisólido, la

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 motilidad se observa como turbidez alrededor del inóculo, en cambio

las bacterias no móviles (ausencia de flagelos) solo se desarrollan en el

trayecto del inóculo inicial. Teniendo todo lo anterior en cuenta, y

observando los resultados plasmados en la Figura 2 donde se puede ver

ausencia de ennegrecimiento, ausencia de anillo rojo después de

agregado el reactivo, y crecimiento estático en la línea de siembra, se

puede concluir que la bacteria Klebsiella pneumoniae dió negativo

para todas las pruebas lo que concuerda con lo obtenido por Koneman

et al en el 2004

(a) (b)

Figura 2. Prueba de SIM antes (a) y después (b) de la incubación

4.1.3. Prueba de Voges-Proskauer y reacción del rojo de metilo (medio

MRVP)

4.1.3.1. Prueba rojo de metilo

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 4.1.3.2. Prueba de Voges-Proskauer (VP)

La reacción VP consiste en detección de la capacidad de que un

microorganismo fermente la glucosa, ya sea por la producción

de un producto final neutro como la acetoína o la formación de

ácido por la vía de ácido mixta. Algunas cepas del grupo

Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Hafnia utilizan la vìa de

producción de acetoína con formación de pequeñas cantidades

de ácidos mixtos insuficientes para descender el pH, y que el

rojo de metilo cambie el color de la muestra, por eso es que

algunas enterobacterias Voges-Proskauer positivas son rojo de

metilo negativas y viceversa.

(a) (b)

Figura 3. Prueba de MRVP antes (a) y después (b) de prueba de rojo

de etilo (izquierda) y Voges-Proskauer (derecha)

4.1.4. Prueba de Urea de Christensen

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En la Figura 4 se puede observar un cambio de color en la prueba de

Urea, antes y después de la incubación de Klebsiella pneumoniae,

obteniendo un resultado positivo para la actividad de Ureasa. Dicho

resultado, se debe a que la prueba de Urea es un medio diferencial,

no selectivo, el cual posee un indicador de pH rojo de Fenol, de esta

manera los microorganismos capaces de clivar la urea, formando

amoniaco y dióxido de carbono, lo cual alcaliniza el medio, y el

indicador hace que este cambie de color beige (ver Figura 4a) a rosa

fuerte (ver Figura 4b), por el contrario cuando el microorganismo no

descompone la urea y fermenta la glucosa, el medio se torna ácido, y

no cambia de color.

(a) (b)

Figura 4. Prueba de Urea antes (a) y después (b) de la incubación

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4.1.5. Prueba de Lisina descarboxilasa

Esta prueba como muchas otras posee un indicador de pH que cambia

el color del medio cuando este se torna ácido, este agar contiene como

carbohidrato fermentable la glucosa, y cuando la enterobacteria realiza

esta fermentación se acidifica el medio, condición esencial para que la

enzima lisina descarboxilasa actúe (si está presente), en consecuencia

el medio cambia de color de violeta oscuro a amarillento, sin embargo,

si esta posee la enzima y se descarboxila la lisina se produce una

diamina (cadaverina) que neutraliza el medio, de esta manera el medio

retoma su color original violeta, aunque un poco más claro (ver Figura

5b)

(a) (b)

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 Figura 5. Prueba de Lisina antes (a) y después (b) de la incubación

4.1.6. Prueba de TSI

Esta prueba se emplea para detectar la fermentación de azúcares

(lactosa, sacarosa y glucosa), que se demuestra gracias al rojo de

fenol, el cual es un indicador de pH que cambia el color del medio

(àcido: amarillento, alcalino: rojo anaranjado), formación de gas

(aerògeno), y ya que posee sulfato ferroso, ayuda a la demostración de

producción de ácido sulfhídrico, provocando ennegrecimiento en el

fondo. observando los resultados obtenidos al incubar Klebsiella

pneumoniae en TSI (ver Figura 6b) en comparación con el agar puro

(ver Figura 6a), por su cambio de color de rojizo a amarillento y la

presencia de burbujas en el fondo, se puede concluir que hubo

fermentación de glucosa y lactosa con producción de gas, lo que llevó

a la acidificación de todo el medio.

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 (a) (b)

Figura 6. Prueba de TSI antes (a) y después (b) de la incubación

4.1.7. Prueba en agar Mc Conkey

El agar de Mc Conkey es un medio tanto selectivo como diferencial, ya que

inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y el indicador de pH rojo

neutro permite la diferenciaciòn de las bacterias que fermentan la lactosa

(colonias rosa intenso con halo de precipitaciòn) de las no fermentadoras

(colonias transparente o ambar). Como se puede ver en la Figura 7b se

obtuvieron colonias rosa intenso, con halo de precipitaciòn alrededor de la

lìnea de incubaciòn, esto quiere decir, que la enterobacteria utilizada (K.

pneumoniae) es fermentadora de lactosa.

(a) (b)

Figura 7. Prueba en agar Mc Conkey antes (a) y después (b) de la incubación

4.2. Caracterización bioquímica de bacilos: Bacillus Cereus

4.2.1. Prueba en agar (gelatina, almidón)

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 Para observar los resultados de esta prueba, se agrega cloruro de

mercurio, inmediatamente el medio cambia de color a blanco,

señalando la gelatina no hidrolizada (ver Figura 8b), despuès de esto se

lava con agua destilada, pero al realizar este procedimiento hubo un

error sistemático, que resultò en la pèrdida de las colonias que habían

crecido;

(a) (b)

Figura 8. Prueba en agar gelatina antes (a) y después (b) de la incubación

(a) (b)

13
Figura 9. Prueba en agar almidón antes (a) y después (b) de la incubación

4.2.2. Prueba en caldo ( glucosa, arabinosa, xilosa, nitrato)

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5. Conclusiones

6. Referencias

(1)

[2]

[x] MacFaddin, G. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica. Argentina: Médica Panamericana.

[y] Ingraham, L. e Ingraham, C.(1998). Introducción a la microbiología. II. España:

Reverté.

7. Anexos

7.1. ¿Qué otro tipo de pruebas existen para la identificación de

microorganismos? Explique su principio, mínimo 3.

● Catalasa. La catalasa es un enzima presente en la mayorÌa de los

microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan

catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno

gaseoso que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de

esta prueba es separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp.

y Enterococcus spp. (negativa).

● Hidrólisis del hipurato. Demuestra la capacidad de algunas bacterias

para hidrolizar el hipurato de sodio ácido benzoico y glicina por la

acción de la enzima hipuricasa. Como indicador de la reacción se

utiliza ninhidrina. Esta prueba se utiliza en la identificación de

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 Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis

y Streptococcus agalactiae.

● Aminopeptidasa: PYR. La Lpirrolidonil-β-naftilamida sirve como

sustrato para la detección de pirrolidonil peptidasa. Se utiliza

principalmente en la identificación de Streptococcus pyogenes y

Enterococcus spp. También en la diferenciación de Staphylococcus

lugdunensis de otros estafilocos coagulasa negativa.

● Reducción de nitratos. Sirve para determinar la capacidad de un

organismo de reducir el nitrato en nitritos. Se utiliza para asignar

bacterias a la familia Enterobacteriaceae, en la diferenciación de

Moraxella catarrhalis del género Neisseria y en la identificación de

bacilos grampositivos aerobios.

● Prueba de CAMP. Sirve principalmente para determinar la capacidad

de un microorganismo para producir una proteína conocida como

factor CAMP. La proteÌna produce un efecto sinérgico con la

β-hemolisina de S. aureus sobre eritrocitos ovinos y bovinos que se

observa como un fenómeno lítico en la intersección de los dos

microorganismos cuando se siembran en proximidad. Como alternativa

se puede utilizar el CAMP inverso. En esta prueba la hemólisis

producida por algunos microorganismos se inhibe por la β-hemolisina

de S. aureus (por ejemplo, la producción de fosfolipasa D de

Arcanobacterium haemolyticum o la fosfolipasa E de Rhodococcus

spp.) (x)

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7.2. Existen bacterias que tienen una acción hemolítica, confirmadas por

medios selectivos y pruebas bioquímicas. Liste por lo menos 3 bacterias

que tengan confirmadas esta acción y justifique por qué son riesgosas en

el ser humano y cuáles son los productos alimenticios que se ven

grandemente afectados por la presencia de estas bacterias.

Algunas de las bacterias que tienen acción hemolítica son la L.

monocytogenes, L. seeligeri y L. ivanovii, Streptococcus salivaris,

Micrococcus luteus, Bacillus cereus, E.coli, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa. El peligro de dichas bacterias se debe a que estas

causan causa un amplio espectro de enfermedades, que van desde cuadros

leves como faringitis, amigdalitis, impétigo y escarlatina, hasta infecciones

invasivas graves, como meningitis, fascitis necrotizante o septicemia y otras

que pueden provocar la muerte. Estas bacterias pueden estar presentes en

alimentos crudos, como productos derivados de la leche o res, también

ensaladas (papa, atún, camarones, fideos y pollo), vegetales crudos, y aves. (y)

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