Tema 11

IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS

Módulo: ensayos microbiológicos

CFGS LACC

Curso 2021/22

Laura Callado Ampudia

 Tema 11 Ensayos Microbiológicos

1. INTRODUCCCIÓN

Para identificar microorganismos se requieren 3 niveles básicos:

 Observación de la morfología macroscópica, es decir, tipo de colonias formadas a

simple vista en un cultivo joven.
 Observación microscópica, con o sin tinción en el microscopio.
 Tipificación bioquímica: estudio y seguimiento del metabolismo bacteriano.

2. MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA

La morfología de una colonia bacteriana y su entorno, en relación con el medio

donde se ha desarrollado, es un dato orientativo y en ocasiones, muy importante para la
identificación del microorganismo.

Los aspectos que se estudian de una colonia son la forma, elevación, borde, colory
consistencia de las colonias.

También se estudian la forma de las colonias en agar inclinado sembrado por

estrías.

Figura 1. Aspecto de las colonias

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3. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

Es el segundo paso de cualquier investigación.

La observación microscópica se puede realizar en fresco o en preparaciones

teñidas.

Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es

importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características
morfológicas de interés.

4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Las pruebas bioquímicas, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o
ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía
metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano.

Para llevarlas a cabo se utilizan medios de cultivo selectivos y diferenciales, donde

aparecen:

 Cambios de color debidos a la aparición de ácido en el medio que se

detecta con indicadores de pH (microorganismos que producen
fermentación de azúcares).
 Aparición de gas (detectable con campanas Durham
 Hidrólisis de proteínas, hemólisis, producción de H 2S, etc.

La realización de una prueba bioquímica implica:

Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o

inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la
presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato

de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

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En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 horas de incubación) en
un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, atmósfera y
temperatura adecuados.

A continuación, se exponen algunas de estas pruebas bioquímicas:

Prueba de la catalasa: es la enzima que cataliza la rotura del peróxido en oxígeno y

agua. El peróxido de hidrógeno se forma como producto terminal en la degradación
aeróbica de los hidratos de carbono. La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de
los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromos. En
esta prueba se pone en contacto un cultivo joven del microorganismo, con peróxido de
hidrógeno. Si hay formación de burbujas de oxígeno se dice catalasa+.

Prueba de la coagulasa: es otra prueba enzimática rápida utilizada en la identificación

bacteriana. Se realiza solo cuando se sospecha que la colonia aislada puede ser un
estafilococo.

La coagulasa es un enzima que provoca la formación de un coágulo cuando las bacterias

son incubadas con plasma. La posesión de esta enzima coagulasa es una propiedad casi
exclusiva de Staphylococcus aureus (S. aureus). Para realizar esta prueba se emulsiona
parte de una colonia en una gota de plasma de conejo colocada sobre un portaobjetos
de vidrio. La formación de grumos en el portaobjetos en un minuto indicará la presencia
de coagulasa y un resultado positivo de la prueba.

Utilización del citrato: prueba que estudia el metabolismo de los hidratos de carbono.
Esta prueba es de utilidad en la caracterización de las enterobacterias. Se utiliza el agar
citrato de Simmons. Este medio contiene citrato como única fuente de carbono,
fostato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH.

Las bacterias capaces de metabolizar el citrato son las que se multiplican en este medio,
utilizando los fosfatos y liberando iones amonio, provocando una alcalinización del
medio que hace virar al indicador.

Se puede realizar en placas o slants. Las bacterias se transfieren al medio y este se

incuba a 37ºC durante 24 o 48 horas antes de su examen e interpretación. Se estudian
dos aspectos: el crecimiento en el medio y el cambio de color.

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Prueba de Voges Proskauer (VP): Este ensayo pone en evidencia la capacidad del
microorganismo de producir acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación
butilen-glicólica de la glucosa. Los productos finales son compuestos como butanodiol y
etanol, produciéndose acetoína como intermedio(acetil-metil-carbinol) que con
hidróxido de potasio y solución naftol (reactivo de Voges – Proskauer 1 y 2) produce un
color rojo rosado.

La prueba se realiza inoculando el caldo MR-VP o medio de “Clark-Lubs” con la bacteria

problema durante 24 horas. Tras la incubación se le añaden dos reactivos: alfa-naftol
5% en etanol absoluto (un intensificador del color) e hidróxido de potasio al 40%.

Importante la exposición al oxígeno atmosférico para obtener una reacción de color. La

aparición de color rosado o rojo en la superficie del medio indica que la acetoína está
presente. Si no se produce cambio de color en el medio o aparece un color cobrizo se
considera resultado negativo.

Prueba del rojo de metilo (RM): la prueba se utiliza también en enterobacterias,

para estudiar la vía de fermentación ácido-mixta, seguida por bacterias como E.coli o
Proteus vulgaris en la que se producen una gran cantidad de ácidos a partir de piruvato

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(láctico, acético, y ácido fórmico).

Para realizar esta prueba se debe incubar la bacteria en el mismo caldo MR-VP o medio
de “Clark-Lubs”, al igual que en la prueba anterior pero esta vez incubarlo más de 48
horas, recomendado de dos a 5 días. Tras la incubación se añaden 5 gotas del indicador
de pH rojo de metilo. Se agita el tubo entre las palmas de las manos. Se considera un
resultado positivo la aparición de una coloración roja en el medio de cultivo.

Fermentación de la glucosa (prueba de Hugh y Leifson): (OF) capacidad de

algunas bacterias de metabolizar la glucosa por vía oxidativa o fermentativa. El medio
utilizado para realizar la prueba es el medio O/F. Se trata de un medio semisólido que
debe ser suplementado con el hidrato de carbono a estudiar. Este se añade al medio en
el momento de su preparación a una concentración final del 1%. El indicador de pH del
medio es el azul de bromotimol que proporciona al medio sin inocular un color verdoso.

La prueba se realiza en dos tubos que son inoculados con la bacteria problema. Tras la
inoculación por punción, uno de los tubos se cubre con dos o tres mililitros de aceite
mineral estéril que se encarga de crear en el tubo el ambiente anaerobio. Los dos tubos
son incubados a 37ºC durante 48 horas con los tapones flojos, antes de la
interpretación del cambio de color.

Interpretación: cuando el azúcar es metabolizado se forman ácidos que hacen virar el

pH y por tanto el color del medio, que experimenta un viraje a amarillo. En el
metabolismo fermentativo, el aceptor final es una molécula orgánica y se puede llevar a
cabo en presencia o en ausencia de oxígeno, por tanto, cultivos en aerobiosis o en
anaerobiosis. Hay producción de ácidos (orgánicos) en los dos cultivos (OF – O y OF –
F). La formación de ácido se pone de manifiesto con un indicador que lleva el medio. La
aparición de gas provoca burbujas o rotura del agar en el fondo del tubo de ensayo.

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Fermentación de azúcares: se realiza en medios de cultivo líquido, es decir, en

caldos. Algunos microorganismos, como son los pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae, fermentan la glucosa y también la lactosa con producción de ácido
y gas. Con un indicador de pH en el medio se comprueba la producción de ácido y con la
utilización de la campana Durham se observa la producción de gas.

Prueba del Indol: esta prueba determina la capacidad de un microorganismo para

producir indol a partir de triptófano. El triptófano es un aminoácido que puede ser
hidrolizado por la enzima triptofanasa para formar indol, ácido pirúvico y amonio. Se
utiliza en el laboratorio para diferenciar, dentro de las enterobacterias, las especies
indol positivas de especies indol negativas.

La prueba se realiza incubando la bacteria en un medio que contenga triptófano, como

el agua de peptona, en la estufa a 37ºC de 18 a 24 horas. Transcurrida la incubación se
agregan al tubo unas gotas (unas 15) del reactivo de kovacs o de reactivo de Ehrlich
según preferencia del laboratorio.

Ambos llevan el producto p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA). Este producto se

combina con el indol para dar lugar a un producto de color rojo intenso en la superficie
del cultivo. Un resultado negativo del test vendría dado por la aparición de un anillo de
color verdoso.

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Movilidad: se puede realizar mediante el ensayo de la gota pendiente con microscopio,

o bien mediante cultivo en un caldo con 0,1 % - 0,2 % de agar que permite la
migración de las bacterias. Un crecimiento difuso a partir del punto de inoculación se
considera positivo.

Reducción de nitratos: algunos microorganismos utilizan nitrato como último aceptor

de electrones en su metabolismo. El proceso de reducción de nitratos es catalizado por
la enzima nitrato-reductasa. La reducción a nitritos se pone de manifiesto cuando al
cultivo incubado en agar nitrato se le añade el reactivo de Griess (I y II).

Aminas
❑

−¿→ NO−¿→ Amoniaco

N →¿
2
¿
NO 3 2

Hidroxilaminas

Algunos microorganismos reducen también a los nitritos. Para su detección se utiliza

polvo de cinc.

Prueba de la ureasa: la enzima ureasa cataliza la hidrólisis de la urea produciendo

dióxido de carbono o carbonato amónico como producto final que alcaliniza el medio y
produce el viraje del indicador.

Prueba en agar con hierro de kliger (KIA): medio de cultivo para la diferenciación
de enterobacterias en base a su capacidad para fermentar glucosa y lactosa, y producir
ácido sulfhídrico.

En realidad, el medio AGAR HIERRO-DOS AZÚCARES DE KLIGER nos informa en la

misma prueba sobre cuatro aspectos importantes de la bacteria. Este medio lleva en su

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composición dos azúcares (glucosa y lactosa) en diferente proporción, la lactosa (1%)

está diez veces más concentrada que la glucosa (0,1%) y permite determinar la
capacidad de la bacteria sembrada en él para utilizar ambos azúcares, junto con la
producción de gas y ácido sulfhídrico.

Este medio se inocula por picadura haciendo después una estría simple en la superficie
de siembra al sacar el asa y se incuba a 37ºC, entre 18 y 24 horas, no más.

Un exceso de incubación podría dar lugar a errores en la interpretación.

SISTEMAS MULTIPRUEBAS

Test SIM: medio de cultivo agar SIM (sulfuro, indol, movilidad) para enterobacterias.
Se siembra en agar horizontal por picadura para la comprobación de:

 Formación de sulfuro, que con el hierro (III) presente ennegrece el medio.

 Formación de indol, que se comprueba con el reactivo de Kovacs.

 Movilidad, que se pone de manifiesto por la turbidez del medio de cultivo

alrededor de la picadura.

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Formación de sulfuro Formación de indol Movilidad

Test IMVic: se utilizan los medios MR-VP, Simmons Citrato y agua de peptona,
realizándose las siguientes pruebas:

 Indol.

 Rojo de metilo- Voges Proskauer.

 Utilización del citrato.

5. SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN POR “KITS”

Son métodos más modernos de identificación de microorganismos, son galerías de

identificación rápida.

Uno de los sistemas más utilizados es el de “sistemas API” o galerías API. Por
ejemplo, la galería API 20 E es un sistema de identificación de la Enterobacterias y
otros bacilos gram negativos mediante 20 test bioquímicos estandarizados y
miniaturizados, cuyos resultados se buscan en una base de datos.

La empresa BioMériux fabrica diferentes tiras según el rango de bacterias a

identificar:

 API 20E: Identificación de bacilos G-. Incubación 18-24 horas

 API 20NE: Identificación de bacilos G- no enterobacterias. Incubación 24-
48 horas.
 API Staph: Identificación de stafilococos y micrococos. Incubación 18-24
horas.

Del conjunto de reacciones y resultados después de la incubación se obtiene un

perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos están separados en grupos de tres: en total

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tenemos 7 grupos de tres tubos o pocillos (el test número 21 corresponde al test de la
oxidasa).

Para obtener el perfil numérico de 7 cifras, a cada pocillo se le dará el valor:

- Si la reacción es negativa se pone 0

- Si la reacción es positiva se pone 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2
si es el segundo, 4 si es el tercero

Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se
obtiene un código de 7 cifras. Con este código se busca en la tabla de identificación la
especie de que se trata, para realizar esta operación hay programas informáticos.

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Otro método de identificación de microorganismos es el enterotubo.

BBL Enterotube II es un tubo de plástico con compartimientos, formado por 12

medios de cultivo diferentes, que permiten la identificación de 15 reacciones bioquímicas.
Está concebido para la inoculación simultánea de los 12 medios con una sola colonia,
utilizando una aguja de inoculación dispuesta en el centro. La combinación de reacciones
resultantes, junto con la guía de interpretación (libro de códigos), permite la
identificación de Enterobacteriaceae.

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Tras su inoculación el tubo es incubado a 37ºC durante 24 horas. Se examina el

cambio de color que han experimentado los compartimentos y se registra cada uno como
positivo o negativo. Estos resultados se utilizan para determinar un número de
identificación que corresponde a una especie bacteriana.

Sistemas automatizados

Existen sistemas que efectúan la inoculación, incubación y lectura de galerías

multiprueba miniaturizadas de manera automática, evaluando los resultados en un
ordenador que realiza la determinación.

Uno de ellos es el sistema Vitek en el que se utilizan pequeñas tarjetas de plástico

que contienen cantidades pequeñas (del orden de microlitros) de varios medios de
identificación en 30 pocillos. Los resultados obtenidos en estas pruebas determinan un
perfil bioquímico que permite la identificación del microorganismo. El aparato realiza la
inoculación de las tarjetas a partir de los cultivos y lee los cambios de color producidos
en los pocillos por fotometría. Los datos obtenidos son analizados y almacenados en un
banco de datos.

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