AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA

I.INTRODUCCION

Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que los rodea,

captando sustancias necesarias para su multiplicación y liberando al medio
producto de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo
bacteriano establece con el entorno son propias y características, esta
especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un
determinado equipo enzimático. Por ello, la caracterización de dichas enzimas
es una útil herramienta para la identificación y clasificación bacteriana.

Po lo anterior, el examen y conocimiento de características, no solo

morfológicas, sino bioquímicas y fisiológicas, combinadas todas, permiten
conocer caracteres fenotípicos útiles para la identificación de los
microorganismos, y ponen en evidencia sus capacidades que ayudan a explicar
propiedades ecológicas de los microorganismos en estudio.

La batería de pruebas bioquímicas que se empleara serán las clásicas y

general de identificación, en este caso, para enterobacterias (bacilos
Gramnegativos); sin embargo, actualmente estos métodos están siendo
sustituidos por micro pruebas en sistemas semiautomáticos, que permiten una
identificación más rápida y menos laboriosa imprescindible en grandes
laboratorios (sistema API, etc.). También se emplean otros métodos no
bioquímicos basados en técnicas serológicas o en técnicas biomoleculares
(Hibridación de ácidos nucleicos, PCR, etc.).

II. OBJETIVOS

2.1.Aplicar e interpretar algunas de las pruebas bioquímicas de

identificación y/o caracterización bacteriana.

2.2.Aplicar la técnica del agotamiento por estrías para la obtención de

cultivos puros y practicar la técnica de transferencia aséptica.

2.3. Conocer y ejercitar el uso de diversos tipos de claves diagnosticas

para determinación de géneros y especies de microorganismos.

III. MATERIALES

3.1. Material biológico

 2 Cultivos bacterianos de la familia Enterobacteriaceae: bacilos

Gramnegativos, aislados de placas con Agar MacConkey (1
cultivos Lactosa positivos y 1 cultivos Lactosa negativos).

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 3.2. Material de laboratorio

 Tubos de ensayo con medio Hugh y Leifson

 Tubos de ensayo con medio Movilidad.
 Tubos de ensayo con agar TSI
 Tubos de ensayo con agar LIA
 Tubos de ensayo con Agar citrato de Simmons
 Tubos de ensayo con caldo peptonado
 Tubos de ensayo con caldo RMVP
 Asa bacteriológica calibrada
 Asa bacteriológica en punta
 Mechero de alcohol
 Prueba de la citocromo oxidasa1
 Reactivo de Kovacs
 Rojo de metilo (pH 4,0)
 Hidróxido de potasio 0,1M
 Alfa naftol.

IV. PROCEDIMIENTO

 A cada uno de los cultivos de enterobacterias realizar la prueba de la

citocromo c oxidasa. Con un asa de siembra de platino o con un palillo
de madera extender el cultivo sobre la tira de papel reactiva para
citocromo c oxidasa. Observar si aparece una coloración azul (posee
citocromo c, prueba positiva). Esta prueba permite diferenciar el grupo
Enterobacteriaceae (carece de citocromo c) del genero Pseudomonas
(que posee citocromo c).

 A partir de cada cultivo de bacilos Gramnegativos sembrar en los

siguientes medios diferenciales: Hugh y Leifson, SIM, agar TSI, agar
LIA, Agar citrato de Simmons, caldo peptonado y caldo RMVP.

 Incubar todos los medios a 37°C durante 24hrs.

 Añadir los reactivos correspondientes a los cultivos según correspondan.

 Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con ayuda de las
figuras y tablas en anexo identificar las bacterias analizadas.

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 Fig.26. Criterio de separación de cocos y bacilos Gramnegativos

Fig.27. Criterio bioquímicos de separación de bacilos Gramnegativos

(Familia
Enterobacteriaceae).

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V- RESULTADOS

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VI- DISCUSIONES

 Agar MacConkey, este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram

negativos de fácil desarrollo, aerobias y anaerobias facultativas.
 Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de
agua y alimentos.

 Todas las especies de la familia Enterobacterias desarrollan en el mismo. En el

medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los dos agentes que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
 Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.
 Este produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción
en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no
fermentados de lactosa producen colonias incoloras.

 En la prueba de Catalasa; bacterias anaerobias facultativos son bacterias que

proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando oxigeno como aceptor
terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de fermentación
para obtener energía. Ej. Streptococcus, E. coli(bacterias utilizadas en la
práctica). La inmediata aparición de burbujas indica la presencia de catalasa. Las
burbujas proceden del O2 generado en la reacción con la catalasa.

 En la reacción Oxidasa, las colonias bacterianas que tienen actividad enzimática,

como en este caso, desarrollan un color azul oscuro, esto se debe a la reacción de
la oxidasa que presenta un sistema citocromoxidasa que activa la oxidación del
citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o
peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.
 El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena
transportadora de electrones.
 Un método en el cual las colonias oxidasa positivas en agar puede detectarse es
sumergiendo la placa en un reactivo, y buscando colonias azuladas o marrones.

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  La prueba de SIM determina si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de
liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que contienen
azufre produciendo una reacción visible de color negro y por último la capacidad
de desdoblar el indol de la molécula triptófano, además que la consistencia del
medio permite la observación de la movilidad de algunas bacterias. La prueba de
TSI determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono
específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no
de gases, junto con la determinación de posible Microbiología

 La fermentación es un proceso metabólicode óxido-reducción que ocurre en un

medio ambiente anaeróbico y en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve
como el aceptor final de hidrógeno (electrones). En los sistemas de prueba
bacteriológicos, este proceso se detecta observando cambios en indicadores de
pH a medida que se forman productos ácidos.

 La prueba de Citrato determina, si un microorganismo es capaz de utilizar citrato

como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando
alcalinidad. Este método es utilizado para determinar habilidad de las bacterias
para producir ácidos estables por fermentación de la glucosa. La utilización del
citrato como única fuente de carbono produce la alcalinización del medio. Un
medio con azul de bromotimol como indicador de pH. Buscar un color azul
intenso (pH alcalino). La utilización de ácido cítrico, un ácido de seis carbonos
que contiene tres grupos ácidos carboxílicos, se acompaña de una elevación de
pH, de tal manera que la adición al medio de prueba de un colorante específico
vira el color cuando se dan condiciones alcalinas. En la utilización por
Salmonella en el agar citrato de Simmons. El cambio pH provoca un viraje en el
color del indicador.

 La prueba de caldo VP-RM determina la capacidad de algunos organismos de

producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de
glucosa. La reacción de VP se basa en la detección acetoína como producto final
neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Ésta es metabolizada en ácido
pirúvico, intermediario clave en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, una
bacteria puede seguir muchas vías. La producción de acetoína (precursor de la
producción de 2,3-butanediol) que es uno de los ciclos para la degradación de la
glucosa en las bacterias. La formación de acetoína y butilenglicol es una vía
alternativa del metabolismo del ácido pirúvico. Las bacterias que utilizan esta
vía producen solo pequeñas cantidades de ácidos mixtos que son insuficientes
para disminuir el pH del medio de rojo de metilo, lo bastante como para producir
un cambio de color. Por este motivo muchas de las especies de Enterobacterias
son VP positivas, con pocas excepciones son RM negativas y viceversa.

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  En la prueba del Caldo Común se da la conversión del triptófano de las proteínas
en indol, la detección del indol se realiza en medio de cultivo con
dimetilaminobenzaldehído. Este método empleado para determinar si la bacteria
a través de Triptofanasas puede degradar el Triptófano a indol, también para la
determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados y por
último para determinar si la bacteria es móvil.

VII- CONCLUSIONES

 Agar MacConkey: Los microorganismos no fermentados de lactosa producen

colonias incoloras. La suspensión de Escherichia coli, Klebsiella evidencian
formación de colonias rosadas; mientras que la suspensión deProteus vulgaris,
Salmonella se observa colonias transparentes, finas, amarillentas, agrupadas y
dispersas por todo el agar, lo cual indica que no se fermentó con la lactosa.

 En la prueba de Catalasa ambas bacterias (Proteus vulgaris y Staphylococcus)

burbujean ya que son aerobios facultativos.

 En la reacción Oxidasa, las colonias bacterianas que tienen actividad enzimática,

como en este caso, desarrollan un color azul oscuro; esta reacción fue positiva
para la Pseudomonas, con la E. coliresultó negativo.

 Mediante la prueba de SIM los organismos móviles migraron de la línea de

siembra y se difunden en el medio provocando turbulencia, es una reacción
positiva, para nuestro caso se trató de la Escherichia coli; un crecimiento
bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra; es una reacción negativa,
tratándose de la Salmonella.

 En la prueba de TSI, con la Escherichia coIise evidenció la fermentación de la

lactosa, crecimiento microbiano y producción de gas, ocasionando la ruptura del
agar; con la Salmonella se observó la variación a color guinda, la fermentación
de glucosa y producción de H2S.

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  En la prueba del Citrato una prueba positiva está representada por la aparición
de un color turquesa en 12 o 24 horas, lo que indica que el microorganismo en
estudio ha utilizado el citrato contenido en el medio con la producción de
productos alcalinos, reacción ocurrida con la Salmonella y reacción negativa con
la Escherichia coli. Microbiología

VIII- BIBLIOGRAFÍA

MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos,

Editorial Mc Graw Hill, 10ma Edición, Impreso en España 1998, Capitulo 5, 6 y 24,
Páginas:162, 108, 797-809.

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/morfologiayestructurabacteriana.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Incubadora

http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap16.htm Microbiología

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