TEMA 6.

IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

1. IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos

convencionales, basados en las características fenotípicas y genotípicas.

Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en

las características observables de las bacterias, como su morfología,
desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas.

En ningún caso, los métodos de identificación fenotípica pueden proporcionar

una certeza absoluta. ⁄nicamente indican cual es el género y/o la especie a la
que la bacteria identificada tiene mayor probabilidad de pertenecer.

Los métodos de identificación genotípicos están basado en el estudio de los

ácidos nucleicos y suelen reservarse para las bacterias que no se pueden
identificar con métodos convencionales.

1.1. Fundamentos de la identificación fenotípica

La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente en la

comparación de las características fenotípicas de bacterias desconocidas con
aquellas de cultivos tipo.

En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres niveles

de procesamiento:

a) El primer nivel de identificación son pruebas primarias, las cuales son

rápidas y sencillas de realizar, como la morfología en la tinción de Gram u
otras tinciones, crecimiento en diferentes atmosferas de incubación,
crecimiento en varios tipos de medios de cultivo, oxidasa y catalasa.
Utilizando estas pocas pruebas generalmente es posible situar a las
bacterias, de manera provisional, en uno de los principales grupos de
importancia médica.

b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que

pertenece el microorganismo.

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c) Por ˙último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de
especie. El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar
con un alto grado de precisión la mayoría de las bacterias clínicamente
significativas.

1.1.1. Características microscópicas

El estudio microscópico en fresco y tras tinción revela la forma, la manera de

agruparse, la estructura de las células y su tamaño. Las tinciones son el primer
paso, y ocasionalmente el único, para la identificación bacteriana.

Lo más habitual es realizar una tinción de Gram y su posterior observación con

el microscopio óptico. Así, podremos valorar la forma y tamaño bacteriano y su
agrupación (cocos en cadena, en pareja, en tétradas, racimos, etc.). Además,
nos aportará una primera clasificación, diferenciando entre bacterias Gram+ y
Gram-.

1.1.2. Características macroscópicas

Las características morfológicas más importantes a estudiar son la morfología y

la propiedad de hemólisis.

1) Características morfológicas de la colonia: tamaño, forma, elevación

sobre el medio, color, etc.

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 2) Hemólisis: Alguna bacterias producen hemolisinas, unas exoenximas
que causan eritrosis en medios que contienen sangre.

Se realiza un cultivo en agar sangre, y dependiendo del resultado se

distingue entre:

a) Hemólisis alfa o incompleta : Es una hemólisis parcial y la zona de

crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso.

b) Hemólisis beta o completa: Las colonias quedan rodeadas por un

halo transparente. Se debe a una hemólisis total.

c) Negativo a hemólisis: No se observan cambios en el agar.

1.1.3. Crecimiento en medios de cultivo

Las características del crecimiento en los distintos medios y agares, en las

distintas atmósferas de incubación, etc., ayudan a la identificación.

1.1.4. Pruebas bioquímicas

Permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de

identificación.

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Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de
una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas
pocas horas.

Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con

una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las
pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la
sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios
de identificación que contienen el sustrato a metabolizar.

Las pruebas bioquímicas se pueden clasificar en 4 grupos: pruebas inmediatas,

pruebas rápidas (lectura en < 6 horas), pruebas diferidas (lectura en 18-48
horas) y pruebas de sensibilidad/resistencia.

1.1.4.1. Pruebas inmediatas

Existen 2 pruebas de lectura inmediata que se aplican en la caracterización

inicial de la mayoría de las bacterias. Estas pruebas valoran dos enzimas:

a) Catalasa: La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los

microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan
catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso
que se libera en forma de burbujas.

El principal objetivo de esta prueba es separar Micrococacceae (positiva) de

Streptococcus spp. y Enterococcus spp. (Negativa).

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa,

colocando 2 o 3 gotas de solución de peróxido de hidrógeno al cultivo o
llevando una pequeña muestra del cultivo a un porta con peróxido de
hidrógeno. El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia.

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b) Oxidasa: Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas
oxidasas.

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La

reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
citocromoxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es
reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de
hidrógeno según la especie bacteriana.

Por lo general, el sistema citocromo-oxidasa sólo se encuentra en las

bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y, excepcionalmente,
en alguna microaerófila (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias
estrictas carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de
oxidasa va ligada a la producción de catalasa.

Se utilizan tiras de papel impregnadas p-amino-N-dimetil anilina, que se

oxida por la citocromo-oxidasa.

El procedimiento consiste en impregnar la zona coloreada de la tira

reactiva con una masa de bacterias. Se observa si en el transcurso de
un minuto la zona impregnada vira a un color azul violeta:

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1.1.4.2. Pruebas rápidas

Entre las pruebas rápidas, las más habituales son:

a) Prueba de la ureasa: Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad

de los microorganismos para hidrolizar la urea liberándose amoniaco que
alcaliniza el medio. Para detectar la reacción se utiliza un indicador de pH
que vira a rosa intenso cuando el pH aumenta.

Está presente en Proteus spp., Helicobacter pylori y Cryptococcus spp.

b) Hidrólisis de hipurato: La hidrólisis del hipurato es una prueba

fundamental para la identificación de Campylobacter jejuni, y
Streptococcus agalactiae (son hipurato +.

Esta prueba valora si la bacteria sintetiza la enzima hipuricasa. La

hipuricasa hidroliza el hipurato de sodio a ácido benzoico y glicina. Para

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 determinar si se produce esa hidrólisis se utiliza un indicador de la
reacción: la ninhidrina, que cambia de color en presencia de glicina.

c) β -galactosidasa (ONPG): Esta prueba demuestra la presencia de la

enzima β-galactosidasa.

Para conocer si un microorganismo es productor de β-galactosidasa,

basta añadir el compuesto orgánico O-nitrofenil β-D-galactopiranósido
(ONPG) que es incoloro.

Si la bacteria posee las enzimas hidrolizantes (β -galactosidasa), el

compuesto se transforma en ortonitrofenol, un derivado cromogénico de
color amarillo. Todas las bacterias fermentadoras lentas de la lactosa
son β -galactosidasa positivas.

d) Indol: Estudia el metabolismo proteico, especialmente la degradación

del triptófano.

La prueba del indol es una prueba bioquímica realizada en especies

bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el
indol del aminoácido triptófano.

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 La triptofanada es una enzima que degrada el triptófano; en esta
degradación se libera indol. Para detectar si una bacteria es capaz de
degradar este aminoácido se usa un reactivo denominado de Kovac, que
reacciona con el indol formando un compuesto de color rosa intenso.

Un cultivo será indol positivo cuando, tras añadir unas gotas de reactivo
y agitar suavemente el tubo, aparezca un anillo rojo sobre la superficie
del medio líquido:

e) Pirrolidonil peptidasa (PYR): La L-pirrodlidonil-b-naftilamida sirve

como sustrato para la detección de pirrolidonil peptidasa. Se utiliza
principalmente en la identificación de Streptococcus pyogenes y
Enterococcus spp.

Un color rojo/rosa fucsia evidencia la positividad de la prueba.

1.1.4.3. Pruebas diferidas

Las pruebas diferidas (lectura de 18-48 horas) permiten identificar si la bacteria

tiene un metabolismo oxidativo o fermentativo, el tipo de metabolismo
fermentativo que tienen o los sustratos que puede metabolizar.

Se estudia con la inoculación de un microorganismo problema en un medio de

cultivo que contenga el azúcar específico y un indicador de pH. El indicador vira
de color cuando la bacteria acidifica el medio con su metabolismo.

Las pruebas más habituales son:

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a) Agar de hierro de KIGLER: Es un medio sólido dispuesto en pico de flauta
(agar inclinado).

Es una prueba combinada que se usa para la diferenciación de

enterobacterias y que permite determinar diversos parámetros:

 La capacidad de un microorganismo de metabolizar glucosa,

lactosa o ambas.

 Producción o no de gas (C0 2 o H2) como productos finales del

metabolismo de los hidratos de carbono.

 Producción de ácido sulfhídrico (SH2).

El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la

lactosa.

 La fermentación de la glucosa colorea en amarillo el fondo del tubo y

el resto (zona inclinada) queda de color rojo.

 La fermentación de la lactosa (más abundante) deja todo el tubo

amarillo. Además, si se produce gas, el medio se rompe o se separa
del tubo. :

b) Medio de bilis-esculina: Consiste en la detección de microorganismos

capaces de hidrolizar la esculina en esculetina y glucosa.

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 La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un compuesto
castaño oscuro o negro.

Se utiliza para la identificación presuntiva de streptococos del grupo D.

c) Óxido-Fermentación: Se determina si la utilización de los hidratos de

carbono por parte de un microorganismo, se realiza por vía oxidativa
(proceso aerobio) o por vía fermentativa (proceso anaerobio).

Para realizar la prueba se utiliza un medio enriquecido semisólido al que

se le añade glucosa para observar si el metabolismo de este azúcar es
llevado a cabo por vía oxidativa o fermentativa.

Se realiza la siembra en picadura y uno de los tubos se deja tapado

(atmósfera anaeróbica) y otro abierto (atmósfera aeróbica).

Si la vía es la oxidativa, solamente el tubo abierto virará ligeramente en

la parte superior a color amarillo. Si la vía es la fermentativa hay un
viraje intenso a amarillo que comienza en el fondo de los dos tubos:

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d) Reacción de Voges-Proskauer: Permite observar si el microorganismo
fermenta la glucosa por la vía butanodiólica. Si es así, se forma un
producto intermedio (acetoína) que forma un complejo de color rojizo
con el α-naftol (reactivo revelador). Se usa en la identificación a nivel de
especie de enterobacterias.

e) Rojo de metilo: Mediante esta prueba se comprueba la capacidad de

un microorganismo de fermentar la glucosa por la vía ácido mixta con
producción de ácido. Para detectar si se han producido esos ácidos se
utiliza el indicador rojo de metilo.

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 Se utiliza como parte de la identificación a nivel de especie de algunas
enterobacterias.

f) Reducción de nitratos. Sirve para detectar la capacidad de un

microorganismo de reducir el nitrato a nitrito. Se emplea, principalmente
para asignar bacterias a la familia Enterobacteriaceae (prueba
positiva). Se revela añadiendo α-naftilamina y ácido sulfanílico como
reveladores.

Si la suspensión bacteriana se tiñe de rojo es que existe presencia de

nitritos en el medio

g) Coagulasa: La coagulasa es una enzima que convierte el fibrinógeno

en fibrina. Esta prueba permite determinar la capacidad de la bacteria de
coagular el plasma por la acción de la coagulasa y se utiliza para
diferenciar S. aureus (coagulasa positivo) de otras especies de
Staphylococcus.

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h) Fenilalanina-desaminasa (FDA). Esta enzima capacita a la bacteria
para desaminar el aminoácido fenilalanina formando ácido fenilpirúvico,
lo que provoca una acidez que se pone de manifiesto al añadir unas
gotas de cloruro férrico.

Los géneros Proteus, Morganella y Providencia son positivos a esta

prueba, que aparece de una coloración verdosa tras añadir el reactivo.

i) ADNasa: Se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para

hidrolizar enzimáticamente el ADN, produciendo una mezcla de mono y
polinucleótidos.

j) Descarboxilasas: La descarboxilación es una reacción anaeróbica

producida por la acción de enzimas Descarboxilasas que actúan sobre el

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 extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente
amina.

Esta prueba detecta si la bacteria sintetiza este tipo de enzimas y centra

el estudio en tres aminoácidos: arginina, lisina y la ornitina.

La descarboxilación da lugar a la formación de aminas, y estas elevan el

pH haciendo que el indicador vire a violeta.

k) Lipasa: Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de

descomponer las grasas en ácidos grasos y glicerol, por acción de la
enzima lipasa

Se forma un halo opaco alrededor del medio enriquecido con Tween 80

(rico en ácido linolénico).

l) Lecitinasa: La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción

de dicha enzima por determinados microorganismos, capaces de actuar
sobre la lecitina, sustancia orgánica nitrogenada y fosfatada, contenida
principalmente en la yema de huevo

En presencia de esta enzima se forma un halo opaco alrededor de la

colonia.

m) Citrato: Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es

capaz de utilizar citrato como ˙nica fuente de carbono y compuestos
amoniacales como ˙nica fuente de nitrógeno en su metabolismo,
provocando una alcalinización del medio y se verá un viraje del indicador
de amarillo-verdoso a azul intenso (en el medio Simmons, el más
usado). Es reacción típica del género Citrobacter.

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n) Malonato: Esta prueba valora si una bacteria es capaz de utilizar el
malonato de sodio como única fuente de carbono y el sulfato de amonio
como única fuente de nitrógeno.

La prueba se realiza con caldo malonato que contiene malonato de

sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. El aumento de la
alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie de verde a
azul. Los microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa
hacen que el indicador cambie de verde a amarillo.

Se utiliza para diferenciar algunos géneros de la familia

Enterobacteriaceae. La mayoría de las especies de Enterobacter y
Klebsiella utilizan malonato de sodio.

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 o) Prueba de CAMP: Se utiliza para determinar la capacidad de una
bacteria de producir una proteína conocida como factor CAMP, y permite
la identificación presuntiva de Streptoccocus beta-hemolíticos (S.
Aureus). Los microorganismo beta-hemolíticos producen una lisis total
de eritrocitos cuando se cultivan en agar sangre, lo que hace que la
zona de agar que se extiende alrededor de las colonias quede
transparente.

La reacción CAMP se usa ampliamente para la identificación presuntiva de

S. agalactiae.

p) Sistemas comerciales manuales o Galerías: En la actualidad se

comercializan sistemas semiautomáticos y automáticos en forma de
galerías o paneles, que se incuban y se leen de forma automática. Estos
sistemas consisten en una placa con celdillas identificadas según la prueba
que se desarrolle en ellas y que contienen un sustrato específico para cada
prueba.

Muchos sistemas incorporan también concentraciones seriadas de

antibióticos, de forma que se combina identificación y sensibilidad en el
mismo panel.

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1.1.4.4. Pruebas de sensibilidad/resistencia

Este grupo de pruebas proporciona información sobre la sensibilidad de las

bacterias a ciertas sustancia o, planteado a la inversa, sobre su resistencia a
ellas.

Para las pruebas de sensibilidad/resistencia se utilizan diferentes antibióticos y

tienen diferentes objetivos, por ejemplo, determinar la resistencia de una
determinada cepa a un antibiótico específico.

Hay antibióticos de utilidad demostrada que no se usan en clínica, pero sí como

método de rutina para identificar ciertas bacterias.

Son útiles los siguientes:

a) Novobiocina: La resistencia al disco impregnado de novobiocina

identifica a S. saprophyticus.

b) Bacitracina: Esta prueba puede utilizarse en la identificación de

Streptococcus beta-hemolíticos del grupo A.

c) Optoquina: La optoquina a muy baja concentración inhibe el crecimiento de

Streptococcus pneumoniae, mientras que no afecta al crecimiento de otros
Streptococcus alfa-hemolíticos. Por tanto, esta prueba permite saber si una
colona de Streptococcus es del género S. pneumoniae o no.

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d) Solubilidad en bilis: Esta prueba se aplica para diferenciar Streptococcus
pneumoniae (soluble en bilis) de otros Streptococcus alfa-hemolíticos (no
solubles en bilis).

e) Crecimiento en caldo hipersalino: Determina la capacidad de algunos

microorganismos de desarrollarse en medios de cultivo con una
concentración de cloruro sódico del 6.5%. Se aplica para la determinación
de estafilococos.

1.1.5. Métodos químicos

Los métodos químicos analizan distintos componentes de la pared de la

bacteria. La proteómica estudia y caracteriza el conjunto de proteínas que

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expresa un genoma. Se puede hacer con electroforesis bidimensional y
espectrometría de masas. Actualmente se estudia la automatización de la
proteómica y ya existen bases de datos que contienen información de
numerosas huellas peptídicas (de proteínas).

1.1.5.1. Sistema MALDl-TOF

En el momento actual, la espectrometría de masas MALDl-TOF es una de las

técnicas más utilizadas en la rutina de los laboratorios para la identificación de
microorganismos, tanto de bacterias, como micobacterias, levaduras y hongos
filamentosos.

La espectrometría de masas MALDl-TOF se denomina MALDI por sus siglas en

inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization (desorción/ionización por
láser asistida por matriz) y TOF por el analizador Time of Flight (tiempo de
vuelo) que se integra típicamente con fuentes de ionización MALDI.

Este método se basa en que cada tipo de microorganismo genera un perfil o

una huella química (de sus proteínas), que compara con una base de datos de
perfiles y huellas, para así, identificar rápidamente a los microorganismos y
ganar tiempo para administrar el tratamiento correcto al paciente.

Se utiliza sobre colonias crecidas en medio de cultivo y en hemocultivos

positivos, y proporciona una rápida y alta tasa de identificación.

Las ventajas universales de la espectrometría de masas MALDl-TOF son el

alto rendimiento, el bajo coste en reactivos, la aplicación en muestras sólidas y
la facilidad de uso.

En el caso de la identificación tiene especial relevancia la rapidez en la emisión

de resultados, la posibilidad de partir de una porción minúscula de colonia y la
identificación de microorganismos difíciles de identificar por métodos
convencionales.

La principal desventaja es el alto coste del equipo, la imposibilidad de

identificar microorganismos muy relacionados entre sí, o microorganismos que
no estén presentes en la base de datos.

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