Facultad de Ciencias Químicas

Químico Farmacéutico Biólogo

Práctica No.3
“Pruebas IMViC”

Fisiología Bacteriana

Integrantes:
● Chávez Gudiño Diana Guadalupe
● Cortés Ramos Paola Enedelia
● Flores Pérez María de Jesús
● Garza Rodríguez Fátima Monserrat
● Magallón Vadillo Dania Marlen
● Olivera Carrizales Katia Valeria

Dr. Mario Alberto Gaitán Hinojosa

5°A
Coquimatlán, Col. 13 de octubre de 2022
RESUMEN

Cierto número de bacterias, especialmente miembro de las enterobacterias,

pueden llevar a cabo una fermentación en la que el piruvato es transformado
a cierto número de productos distintos. Dentro de las aplicaciones de esta
fermentación se encuentran las pruebas del ImViC, las cuales tienen un
interés especial en la diferenciación de bacterias. Por lo que en esta práctica
se realizaron esas pruebas, cada una de ellas siendo inoculadas con 2
bacterias, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, y cada prueba cuenta
con 2 tubos de ensayo con su medio y cada una fue realizada con un método
diferente, para la prueba de rojo de metilo se inoculó por medio de agitación,
se recogió la bacteria correspondiente para el primer tubo se introdujo el asa
y con esa misma se agitó para mezclar bien la bacteria con el medio y fue el
mismo proceso para el segundo; para la prueba de indol, se inoculó por
medio de punción, se tomó la bacteria y se picó con el asa el medio sin tocar
el fondo del tubo y se saca sin tocar las paredes el mismo procedimiento fue
para el segundo tubo; para la prueba de citratos, debido a que el medio
estaba en pico de flauta se realizó una punción sin tocar el fondo ni las
paredes y un estriado a partir de la superficie hasta terminar todo el pico y por
último para la prueba de Voges-Proskauer se necesito la prueba de rojo de
metilo, se vacio la mitad de cada uno de los tubos en otros 2 tubos de ensayo
limpios, se colocaron 600 microlitros de alfa-naftol y despues 200 microlitros
de KOH finalmente 5 gotas de reactivo de Kovac, se agitó y se dieron los
resultados E. coli + + - - y K. pneumoniae - - + +.

ABSTRACT

A number of bacteria, especially members of enterobacteriaceae, can carry

out a fermentation in which pyruvate is transformed into a number of different
products. Among the applications of this fermentation are the ImViC tests,
which have a special interest in the differentiation of bacteria. So in this
practice these tests were performed, each of them being inoculated with 2
bacteria, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, and each test has 2 test
tubes with its medium and each one was performed with a different method,
 for the methyl red test it was inoculated by means of agitation, the
corresponding bacteria was collected for the first tube the loop was introduced
and with that same one it was shaken to mix the bacteria well with the
medium and it was the same process for the second; for the indole test, it was
inoculated by means of puncture, the bacteria was taken and the middle was
stung with the handle without touching the bottom of the tube and it is
removed without touching the walls the same procedure was for the second
tube; for the citrate test, because the medium was in flute peak a puncture
was performed without touching the bottom or the walls and a striatum from
the surface to finish the entire peak and finally for the Voges-Proskauer test
the methyl red test was needed, half of each of the tubes was emptied in
another 2 clean test tubes, 600 microliters of alpha-naphthol were placed and
then 200 microliters of KOH finally 5 drops of covac reagent, it was agitated
and the results were given. E. coli + + - - and K. pneumoniae - - + +.

INTRODUCCIÓN

La prueba IMViC consiste en diferentes test los cuales son: 1) Producción de

Indol, 2) Prueba rojo de metilo, 3) Voges-Proskauer y 4) Citrato utilizando la
prueba del citrato de Simmons. La palabra IMViC surgió de la primera letra de
cada uno de los test que la componen a excepción de la “i” que fue añadida
para facilitar su pronunciación. La prueba IMViC fue diseñada para diferenciar
microorganismos Gram negativos, específicamente la familia
Enterobacteriaceae, particularmente Escherichia coli y el grupo de
Enterobacterias Klebsiella; esto basado en las propiedades bioquímicas y
reacciones enzimáticas en presencia de sustratos específicos. (Setty, R. S.,
2007).

Prueba de indol: El Triptófano es un aminoácido esencial el cual es oxidado

por algunas bacterias donde la enzima “triptofanasa” genera la formación de
indol, ácido pirúvico y amonio. El indol se forma inoculando una bacteria
dentro de un caldo de triptona, cuando se produce la reacción, es detectada
gracias a la adición de un reactivo de “Kovac” que produce una anillo de
coloración roja en la superficie del caldo. (Setty, R. S., 2007).
 Prueba rojo de metilo y Voges-Proskauer: Estas pruebas arrojan resultados
opuestos, ya que si la prueba rojo de metilo resulta positiva (lo que se
demuestra con una coloración roja en el medio) evidencia que la bacteria es
capaz de fermentar la glucosa por vía ácido-mixta, esto gracias a la
formación de ácidos que se producen mientras que una prueba negativa el
color sera amarillo. Por otro lado, para el Voges-Proskauer se busca
determinar la formación de acetoína o acetil metil carbinol, producido por la
descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico lo cual es también un
producto intermediario en la fermentación, esto conduce a que se forme el
2,3 butanodiol gracias a que la acetoína es un medio alcalino y en presencia
de oxígeno se oxida a diacetilo, el cual reacciona con compuestos como
guanidina o arginina; también se agrega α-naftol para aumentar la
sensibilidad y generar un viraje entre rojo/rosado/violeta evidenciando que el
microorganismo fermenta la glucosa por vía butanodiólica. (Setty, R. S.,
2007).

Por último, el citrato de Simmons determina si un microorganismo es capaz

de crecer utilizando como única fuente de carbono al citrato. Los resultados
se interpretan de la siguiente manera; si en el tubo se observa turbidez es un
resultado positivo ya que hubo crecimiento bacteriano por ende se producen
sales de amonio aumentando el pH y gracias al indicador el medio vira a azul
siendo originalmente verde, por otra parte, si no hay turbidez sería negativo,
ya que no hay presencia de crecimiento ni mucho menos amonio por lo que
el medio continúa siendo verde. (Setty, R. S., 2007).

MARCO TEÓRICO

La familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de

bacilos Gramnegativos, ya sea móviles con flagelos perítricos o no móviles;
se multiplican en medios con peptona o extracto de carne sin que se añade
cloruro de sodio u otros suplementos; se multiplican bien en agar de
MacConkey; proliferan en medios aerobios y anaerobios (son anaerobios
facultativos); fermentan en vez de oxidar glucosa, a menudo produciendo
gas; catalasa positiva, oxidasa negativa, reducen nitrato a nitrito, y tienen un
contenido de DNA de G+ C de 39 a 59%. (Brooks, et al. 2011).
La movilidad bacteriana se puede observar por microscopia en suspensiones
líquidas, por extensión del desarrollo bacteriano en forma de película sobre
agar o como una turbidez que se extiende a través de un agar blando (p.ej.,
0.5%). (Velasco, 2014)

Medio Sulfuro-Indol-Movilidad (SIM)

Se utiliza para detectar movilidad, producción de indol y producción de H2S.

Las peptonas de Caseína y Carne proporcionan nitrógeno, vitaminas,
minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento. La peptona caseína
es rica en triptófano, que se reduce y produce indol. El tiosulfato de sodio
proporciona azufre y el citrato de amonio férrico es el indicador de la
producción de H2S en condiciones alcalinas. Alternativamente se puede
emplear el Medio Movilidad-Indol-Ornitina (MIO) en el que además de
detectar movilidad y producción de indol se aprecia la descarboxilación de la
ornitina. Si los organismos poseen tal enzima, se activará en un ambiente
ácido creado por la fermentación inicial de dextrosa. Una vez que el
aminoácido se descarboxila, se produce diamina putrescina. El resultado es
una alcalinización del medio, que lo convierte en azul oscuro. Los organismos
sin la enzima, permanecerán ácidos debido a la fermentación, dando como
resultado un color amarillo en el medio. (Velasco, 2014).

Caldo RM-VP (Rojo de Metilo y Voges Proskauer)

El medio RM-VP se utiliza en la diferenciación de bacilos Gramnegativos

entéricos sobre las bases de las reacciones de rojo de metilo y
acetilmetilcarbinol (Voges- Proskauer). La glucosa puede ser metabolizada
por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía
utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético,
ácido fórmico), o productos finales neutros (acetilmetilcarbinol). Esta
diferencia en el metabolismo bacteriano podría ser reconocida por la adición
de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos
ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la
presencia de productos finales neutros. (Condalab, 2021).
La presencia de una coloración rojiza que aparece después de adicionar
hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con
glucosa se debe a la oxidación del acetilmetilcarbinol a diacetilo el cual
reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.(Condalab, 2021).

Citrato de Simmons

El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de

citrato permeasas, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El
desdoblamiento del citrato genera progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este último en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos,
que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de
la producción de citrato permeasa. (Drider, et al. 2004).

En K. pneumoniae la ruta catabólica del citrato conlleva la conversión de

oxalacetato en piruvato y anhídrido carbónico. Esta reacción requiere la
presencia de un complejo multienzimático biotinilado unido a membrana
(genes oad GAB), con actividad oxalacetato descarboxilasa (OAD). Este
complejo acopla la reacción exergónica de descarboxilación de oxalacetato a
piruvato, al transporte electrogénico de iones Na+ fuera de la célula,
generando un gradiente electroquímico transmembrana de Na+. Finalmente,
el piruvato es convertido en acetato. (Murray, et.al. 2013).

En E. coli, la ausencia de actividad oxalacetato descarboxilasa trae como

consecuencia, que la fermentación del citrato dependa de la presencia de un
cosustrato oxidable (glucosa, lactosa, piruvato, etc.), que provea del poder
reductor necesario para generar succinato a partir del oxalacetato
proveniente del citrato. En este microorganismo, la malato deshidrogenasa
cataliza la conversión de oxalacetato en malato. Finalmente, el malato es
convertido en succinato por la acción sucesiva de las enzimas fumarasa y
fumarato reductasa. (García, 2010).
OBJETIVO GENERAL
● Que los estudiantes sean capaces de llevar a cabo las distintas pruebas
bioquímicas (IMViC) para la identificación de enterobacterias e identificación
de sus metabolismos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Identificar microorganismos de la familia Enterobacteriaceae en base a la
movilidad, producción de indol, producción de sulfuro de hidrógeno y la
actividad de la ornitina descarboxilasa, en los medios inoculados.
● Diferenciar enterobacterias en base a su capacidad de usar citrato como
única fuente de carbono.

MATERIAL

● Tubos de ensayo con tapón de baquelita de 13x100 mm (Kimax).

● Matraz erlenmeyer de 250 ml (kimax).
● Matraz erlenmeyer de 500 ml (Kimax).
● Mechero fisher.
● Gradilla de 40 plazas.
● Micropipeta de 100-1000 μl (Accupro).
● Micropipeta de 100 μl (Brand Transferpette).
● Puntillas de micropipeta (Brand).
● Encendedor.
● Espátula.
● Papel aluminio.
● Asa en punta.
● Asa bacteriológica.
● Cinta testigo.
● Papel estraza.
● Pizeta.
● Ligas.
● Tripié.
● Rotulador.
REACTIVOS
● Medio de cultivo citrato de Simmons (DIBICO).
● Medio de cultivo SIM (BD Bioxon).
● Medio de cultivo RM-VP (DIBICO).
● Medio de cultivo agar Mueller-Hinton (BD Bioxon).
● Rojo de metilo.
● Reactivo de Kovac (alcohol isoamílico Jalmek: HCl Golden Bell
p-dimetil benzaldehído).
● Hidróxido de potasio al 40%.
● a-naftol al 5% en alcohol etílico Jalmek.
● Cultivo de 24 horas de E. coli en medio de cultivo Muller Hinton.
● Cultivo de 24 horas de K. pneumoniae en medio de cultivo Muller
Hinton.

EQUIPOS
● Potenciómetro (OHAUS SATERTED 2100).
● Autoclave de 25 L de capacidad (All American, 75x) 121°C a 15 libras
de presión.
● Olla de metal para inactivar los medios de cultivo.
● Incubadora (Felisa, FE-141D).
● Balanza analítica (ACCULAB VIC-5101).

METODOLOGÍA
1. Lavar todo el material con escobillón y detergente; enjuagar con agua
corriente.
2. Enjuagar el material con una pizeta llena de agua destilada, dejar
secar en una toalla de papel.
3. Envolver los materiales con papel estraza.
4. Preparar los medios de acuerdo a las indicaciones del bote.
5. Ajustar el pH de acuerdo a las indicaciones.
6. Calentar la solución para eliminar el agua de las paredes del matraz,
agitar frecuentemente.
7. Colocar la solución a los tubos, tapar con papel estraza y sellar con
ligas.
 8. Esterilizar en autoclave.
9. Limpiar el área de trabajo.

Utilización de citrato

1. Rotular cada uno de los tubos con medio de cultivo con el nombre del
microorganismo que va a ser inoculado en él. (Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae)
2. Tomar una colonia de Escherichia coli
3. Flamear la boca del tubo del medio simmons
4. Inocular por estría en superficie.
5. Incubar a 37°C durante 24-48 horas.
6. Observar crecimiento y cambio de color
➔ Repetir los pasos para Klebsiella pneumoniae

MR-VP (Rojo de metilo- Vogues Proskauer)

1. Rotular cada uno de los tubos con medio de cultivo con el nombre del
microorganismo que va a ser inoculado en él. (Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae)
2. Tomar una colonia de Escherichia coli
3. Flamear la boca del tubo del medio
4. Inocular cada uno de los tubos con medios de cultivo por agitación
5. Incubar a 37°C por 48 horas
6. Después del periodo de incubación, pasar asépticamente a un tubo limpio la
mitad de caldo y al tubo 1 agregar 5 gotas de rojo de metilo y observe la
formación de color.
7. repetir los pasos para Klebsiella pneumoniae
8. Al tubo 2 (la otra mitad del caldo) agregar 600 μL de α-naftol al 5% y 200μL
de KOH al 40%.
9. Agite cuidadosamente y deje reposar 30 minutos. Observe si hay aparición
de color.
10. Repetir los pasos para Klebsiella pneumoniae
 SIM, prueba de INDOL

1. Rotular cada uno de los tubos con medio de cultivo con el nombre del
microorganismo que va a ser inoculado en él. (Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae)
2. Tomar una colonia de Escherichia coli
3. Flamear la boca del tubo del medio SIM
4. Inocular por picadura. Tomar muestra e introducir el asa por el centro de la
superficie del medio de manera que siga una trayectoria paralela a la pared
del tubo hasta una profundidad de ¾ del total del medio. Procurar sacar el
asa siguiendo la misma trayectoria.
5. Repetir los pasos para Klebsiella pneumoniae
6. Llevar a incubación a 37°C durante 24-48 horas.
7. Observar el crecimiento en la zona de inoculación y sus alrededores.
8. Agregar 5 gotas de reactivo de Kovac’s y agitar suavemente.
9. Repetir los pasos para Klebsiella pneumoniae
10. Repose unos minutos para que se separe la capa alcohólica.
11. Prueba positiva: Formación de una capa superficial de color rojo. Prueba
negativa: Formación de una capa pero no de color rojo.

RESULTADOS

Tabla 1. Resultados experimentales en prueba de Indol

Bacteria Resultados Imágenes

Prueba positiva. La bacteria produce

E. coli triptofanasa que convierte el triptófano
en indol. Se generó una capa roja en la
parte superior del medio.
 Prueba negativa. No se presentó
K. pneumoniae coloración roja en la parte superior del
medio.

Tabla 2. Resultados experimentales en prueba Citrato

Bacteria Resultados Imágenes

Prueba negativa. No hubo consumo de

E. coli citrato como fuente de carbono, por
ende, no hubo cambio de coloración.

Prueba positiva. Hubo degradación de

K. pneumoniae citrato lo que generó alcalinización del
medio, donde se observó cambio de
coloración de verde a azul.
 Tabla 3. Resultados experimentales en prueba Rojo de metilo y Voges Proskauer

Bacteria Resultados Imágenes

Prueba negativa. No presentó

E. coli coloración roja.

Prueba positiva. Hubo fermentación

formica. Hubo aparición de ácidos por
K. pneumoniae ende cambio de coloración del medio a
rojo.

DISCUSIÓN
Mediante los resultados obtenidos, se pudieron comparar el comportamiento
de las dos bacterias inoculadas: E. coli y K. pneumoniae, en distintas técnicas
bioquímicas.

En la prueba Indol, el tubo que contenía la bacteria E. coli dio positivo, pues
se pudo observar que en la parte superior del medio hubo cambio de
coloración a rojo, formando un tipo anillo. Esto se debe a que, dicha bacteria
cuenta con la enzima triptofanasa, la cual es capaz de oxidar el triptófano con
la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco en un medio enriquecido
con triptófano. (Ramirez-Aguilera y cols, 2018). Por ende, cuando se le
añadió el reactivo de Kovac se formó un complejo rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido. Por otro
lado, la bacteria K. pneumoniae dio negativo en esta prueba ya que carece
de la enzima triptofanasa.

En la prueba de citrato, la bacteria E. coli en este caso dio negativo, ya que,

esta bacteria no utiliza el citrato como fuente de carbono, debido a la
carencia de actividad oxalacetato descarboxilasa que ocasiona que se
necesiten cosustratos, como glucosa, piruvato, entre otros, para la
fermentación del citrato, para poder generar acción reductora para que se
pueda generar succinato con base al oxalacetato que proviene del citrato.
(García, 2010).

Mientras que K. pneumoniae dio positivo a la prueba, pues se pudo observar

que dicha bacteria fue capaz de usar el citrato, el Na+ es liberado, generando
NaOH para ser el medio alcalinizado, así que hay un cambio de coloración,
ya que, el azul de bromotimol vira de verde a azul. A grandes rasgos, en el
proceso de degradación del citrato en K. pneumoniae, se genera una
conversión de oxalacetato en piruvato y dióxido de carbono. Aquí juega un
papel importante la presencia de un complejo, en este caso multienzimático
biotinilado, que debe estar unido a membrana la cual debe de cumplir con la
característica de tener actividad oxalacetato descarboxilasa. El complejo
multienzimático biotinilado debe de generar un acoplamiento de la reacción
exergónica de descarboxilación de oxalacetato a piruvato, para que los iones
de Na+ produzcan un gradiente electroquímico transmembrana, para que así,
el piruvato pueda ser convertido en acetato. (García, 2010).

Finalmente, en la prueba Rojo de metilo y Voges y Proskauer, se pudo

observar que en el tubo que contenía la bacteria E. coli no tuvo cambio de
coloración, por ende la prueba fue negativa y se da por hecho que lleva a
cabo una fermentación ácido mixta. Sin embargo, en el tubo que contenía a
la bacteria K. pneumoniae si tuvo cambio de coloración a rojo, dando una
prueba positiva. Esto se debe a que la bacteria produce la descarboxilación
de dos moléculas de ácido pirúvico que conduce a que se forme el 2,3
butanodiol gracias a que la acetoína es un medio alcalino y en presencia de
oxígeno se oxida a diacetilo, el cual reacciona con compuestos como
guanidina o arginina y junto con el α-naftol genera un viraje rojo/rosado/
 evidenciando que el microorganismo fermenta la glucosa por vía
butanodiólica.

CONCLUSIÓN
Se logró llevar a cabo las distintas pruebas bioquímicas (IMViC), así como
identificar las reacciones que Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae tenían en
cada prueba, comprobando que de acuerdo a la literatura los resultados obtenidos
fueron los correctos, ya que Escherichi coli pertenece a las enterobacterias y como
es mencionado, la prueba fue positiva a indol, que nos indica la presencia de esta
familia. Por otro lado Klebsiella pneumoniae no pertenece a la familia de
enterobacterias, por lo que esta no es capaz de oxidar el triptófano y la prueba
negativa es correcta; sin embargo, Klebsiella pneumoniae es fermentadora de
citratos y también utiliza fermentación formica, que nos indica la aparición de ácidos,
mientras que Escherichia coli dan resultado negativo a estas pruebas.

CUESTIONARIO.
1. Utilizando estructuras proporcione las reacciones que suceden en la
detección de acetilmetilcarbinol.
 2. Para cada especie utilizada investigue
a) Los productos que se forman
b) Las reacciones metabólicas que suceden a partir del piruvato en cada
caso
c) La reacción global a partir de glucosa

La reacción para Klebsiella es la siguiente:

La reacción para E.coli es la siguiente:

RPBI

De acuerdo con la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 sobre el manejo de RPBI,

para que un residuo sea considerado RPBI debe de contener Agentes
Peligrosos Biológicos Infecciosos. Además establece una serie de criterios
para su manejo. Teniendo en cuenta lo anterior en este caso se llevó a cabo
la inactivación de los tubos de ensayo que contenían los medios de cultivo,
mediante la exposición al calor, dentro de un recipiente con agua hirviendo
durante mínimo 5 minutos y después fueron vertidos en la tarja para
posteriormente lavarlos eliminando cualquier resto que pudo quedar en los
tubos del medio.

BIBLIOGRAFÍA

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of citrate permease in lactic acid bacteria. Genet Mol Res. 3:273-81.
● Murray, R.P. Pfaller, M.A. Rosenthal, K.S. (2013). Microbiología Médica.
Editorial Elsevier. España, S.L. Págs: 258,259,288,289.
● García - Quitáns, N. (2010).Instituto de Biología Molecular y Celular de
Rosario, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y
 Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. Suipacha 531, 2000
Rosario, Argentina, y 2 Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo
Superior de Investigaciones Científicas,Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid.
● Velasco,R.(2014).Curso Práctico de Microbiología. Universidad Autónoma
Metropolitana. Unidad Iztapalapa.Páginas: 90-95.
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https://www.condalab.com/int/es/medios-de-cultivo-deshidratados/1202-1489
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● Brooks, G.F. Butel, J.S. Carroll, K.C. Mietzner, T.A. Morse, S.A. (2011).
Microbiología Médica. Editorial Mc Graw Hill Education. México, D.F. Págs:
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de Laboratorio de Microbiología. Universidad de Veracruz. Págs. 45-67.
Consultado el 12 de octubre del 2022 en:
https://www.uv.mx/qfb/files/2020/09/Guia-de-Microbiologia.pdf
● Setty, R. S. (2007). Biotechnology-II: Including Cell Biology, Genetics,
Microbiology. New Age International. Págs: 355-356.