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Test bioqumicos para la identificacin de bacterias.

Introduccion.
Las tinciones simples,diferenciales y estructuralesC(ver capitulo 3), asi como la
obsrvacion de las caracteristicas de una colonia en un cultivo , no son
suficientes para la identificacin de bacterias aisladas.El resultado de la tincin
y el cultivo entones debe combinarse con los resultados en pruebas bioquimas.
Las pruebasbioquimicas evalan las propiedades metablicas de una bacteria
aislada. Esto permite su identificacin usando el siguiente esquema de
identificacin.
Uso de carbodhidatos.
El medio de fermentacin de carbohidratos, como indicado son usados brotes
de cultivos de color rojo , purpura de fenol son usados para ver la capacidad
que tienen ciertos microorgansmos de fermentar varios carbohidratos-Los
carbohidratos tpicamente probados son adonitol,arabinosa, glucosa,
inositol,lactosa, melibiosa,rhamnosa,sorbitol y sucrosa.
Los medio entonces distinguen entre los fermentadores de lactosa entricos
como E.coli, Enterobacter aerogenes y Kleibsiella pneumoniae, de los no
fermentadores de lactosa entricos como Protheus vulgaris,Shigella flexneri y
Salmonella typhimurium.

El cultivo morado contiene peptona, un solo carbohidrato, como plus se agrega


el indicador de pH purpura de Bromocresol. Este indicador es purpura a pH
alcalino, pero amarillo a pH acido. Un pequeo tubo invertido,llamado tubo de
durham, es puesto al fondo como tubo contendor del medio de carbohidrato
para la fermentacin.El tubo recolecta gas ,el cual es un producto de la
fermentacin. El Mo aislado se inocula en el tubo de cultivo purpura o el tubo
de cultivo rojo fenol con un asa esteril.El tubo se incuba de 24 a 48 hrs a 35
c . El cultivo entonces muestra cambio d ecoloracion y produccin de gas.

Consejos para un anlisis exitoso.


-Cuando se inoculan medios de cultivo,al meter el asa en el tubo con el medio
se recomienda friccionar la misma contra las paredes del mismo para
asegurarse que se esta transfiriendo el inoculo.
-Comparar los resultados contra un tubo control no inoculado para determinar
los cambios observado en el medio.

Resultados esperados.
Las bacterias al fermentar carbohidratos
producen acidos, o acidos y gas,
como producto final de la

fermentacin . Los acidos disminuyen el pH del


medio, causando que el
purpura de bromocresol
o rojo fenol vire a a color amarillo, tambin de producirse gases se colectan en
el tubo Durham produciendo burbujeo en el mismo.Pero si las bacterias no
fermentan carbophidratos, el medio permanecer apurpura( el color purpura del
medio usado) o rojo(si el rojo fenol fue el que se uso. Ademas de manera
adicional no se presenta burbujeo en el tubo Durham.Los resultados posibles se
muestran en la figura 5.2 y 5.3.

Fundamento de la tcnica.
La fermentacin es un proceso metabolico de oxido reduccin que ocurre en un
medio anaerobio, donde el aceptor final en la Cadena transportadora de

eectrones no es el oxigeno como


ocurre en procesos aerobios, sino un
sustrato organico distinto. En sistemas
de prueba bacteriolgicos esto es visible por
medio de cambios de coloracin en los mismos en base a
la adicion de indicadores de pH que cambian de color antes pHs acidos lo cual
se logra por la producion final de acidos por el proceso fermentativo.
Las bacterias que suelen fermentar carbohidratos suelen ser anaerobios
facultativos .Por medio del proceso de fermentacin es asi que se que un
carbohidrato se degrada en dos triosas que se vuelven a degradar en
compuestos de 1,2,3 y 4 carbonos .Los producto finales varian respecto a la
especie bacteriana y dependen del sistema enzimtico de las mismas y las
condiciones del medio ambiente .
El ciclo fermentativo de degradaccion de glucosa mas importante es el de
Embden-Meyerhof aun cuando este tambin puede producirse por la derivacin
de la pentosa o bien llamado ciclo de Entner-Duodoroff.Pueden usarse distintos
azucares como sustrato y la bacteria usada depende de las dificultades que se
tienen para identificar un organismo determinado

Utilizando un indicador de pH con un determinado carbohidrato nos puede


indicar si una bacteria a degradado el mismo en varios productos
terminales(donde la naturaleza qumica de los mismos nos dice la identidad de
la bacteria),estos producto terminales acidos entonces ocasionan un viraje del
indicador observando un cambio de color del medio usado.

Microorganismos fermentadores Microorganismos no fermentadores


Fermentadores de glucosa:Todos los No fermentadores de
miembros de las Enterobacteriaceae lactosa:Enterobacterias patgenas
como Salmonella shigella
Fermentadores de glucosa y No fermentadores de
lactosa:Escherichia coli,kleibseilla y manitol:Staphylococcus epidermis
grupos Enterobacter
Fermentadores de No fermentadores de
manitol:Staphylococcus aureus salicina:especies de Corynebacterium
Fermentadores de inositol:Proteus No fermentadoras de rafinosa:Otras
rettgeri especies de Aeromonas
Fermentadores de lactosa:Neisseria No fermentadoras de inositol:Proteus
lactamica morganii
Fermentadores de No fermentadoras de
adonitol:Providencia alcaligenes adonitol:Providencia stuartii
Fermentadores de No fermentadoras de
inulina:Streptococcus salivarius y inulina:Streptococcus del grupo D
Streptococcus sanguis
Fermentadores de sacarosa:Yersinia No fermentadores de sacarosa:otras
enterocolitica especies de Yersinia
Fermentadores de salicilina:Listeria
monocytogenes
Prueba de catalasa.
Procedimento y sumario.
Las clulas bacerianas producen perxido de hidrogeno durante la rspiracion
aerobia. Pero si el perxido de hidrogeno se acumula en la celula,esta se
intoxica.Por esta razn la mayora de las bacterias aerobias y facultativas
aeorobias tienen una enzima llamada catalasa,que se encarga de degradar el
perxido de hidrogeno. Como sea, aalgunas bacterias, de algunas especies
como Streptococos y Enterococos tienen deficiencia de esta enzima. Estas
bacterias entonces se distinguen con facilidad de las bacterias positivas a la
catalasa como especies de Micrococos y Staphylococos. La prueba de catalasa
se hace agregando perxido de hidrogeno al 3% en un medio en tubo de vidrio
en incubacin durante un tiempo de 18 a 24 hrs.El resultado se obsrva como
burbujeo inmediato despus de agregar el perxido de hidrogeno.

Tips para un anlisis exitoso.


- No usar
nunca un medio que contena sangre como
agar sangre y chocolate
pues las clulas rojas tienen catalasa dando falsos
positivos
-Usar una botella nueva de perxido de
hidrogeno debido a que es
muy

inestable .Para asegurar su reactividad


qumica con el organismo positivo a catalasa.

Resultados esperados.
La enzima catalasa ser capaz de degradar el perxido d ehidrogeno en agua y
oxigeno(figura 5.4).El oxigeno causa a formacin de burbujas a los pocos
segundos, dando positivo a la prueba. La ausencia de burbujeo nos indica
negativo a la prueba.Los resultados en tubo de cultivo y frotis son mostrados
en las figuras 5.5 y 5.6 respectivamente.
Uso de citrato
Procedimiento y sumario.
El uso de citrato es la porcin C
en las llamadas pruebas INViC ,
usadas para caratcerizar
bacterias entricas .El citrato
es una molecula organica que
puede ser usada por la bacteria
produciendo la enzima
citrasa.La citrasa es producida
por las bacterias
comoEneterobacter aerogenes
y Salmonella typhirmulium, pero por otras como Escherichia coli y Shigella
flexneri.
El agar de citrqatos de simon ya sea en placa o tubo es usado para determinar
cuando un Mo produce citratrasa.
El medio que contiene citrato es la nica fuente de carbono y como indicador
de pH azul de bromotimol,que es azul a un pH inicial de 6.9 y verde a pH de
7.6.

Para inocular el medio aislado en el tubo o placa de citratos se usa un asa


esteril.El tubo o placa se incuba a 35c por 24 a 48 hrs al examinarlo despus
de este tiempo en el medio se observa crecimiento y un cambio de color.
TTips para un anlisis exitoso
-comparar resultados con un
medio no cultivado para poder
detectar cualquier cambio de
color por comparacin.
-observar un buen crecimiento y
cambio de color, solo puede
deberse a la presencia de
bacterias positivas a la citrasa
pues la nica fuente de carbonos
disponible en el medio es el
citrato.

Resultados esperados.
Las bacterias con la enzima
citrasa metabolizan el citrato con
productos finales alcalinos que
elevan el pH del medio a 7.6, causando
el azul de bromotimol se torne de color azul (figura 5.7).La
presencia de crecimiento asi como el viraje de color a azul nos da un test
positivo a la prueba de citratos .En cambio la ausencia de viraje de color verde
a azul asi como de crecimiento da negativo a la prueba de citratos.Estos
resultados se muestran en la figura 5.8
Prueba de descarboxilasa.
Las descarboxilasas son ensimas que
tienen las bacterias para remover un grupo
carboxilo (-COOH) de los aminocidos.
Este proceso se le llama descarboxilacion, es un paso del
metabolismo de aminocidos . Hay
una enzima descarboxilasa especifica para cada aminocido , pero solo se usan
3 para distinguir en bacterias entricas estas son: lisina
descarboxilasa,ornitonina descarboxilasa,Lisina descarboxilasa,por ejemplo
esta se produce por Enterobacter aerogenes, pero no en Proteus vulgaris.
El medio descarboxilasa es suplementado con uno de los 3 aminoacidos lisina,
ornitonina o arginina para detectar la reaccin de descarboxilacion . Este medio
tambin contiene peptona y extracto de carne para soportar el crecimiento
bacteriano.La presencia de una coenzima llamada pyridoxal permite la
actividad de la descarboxilasa. La glucosa sirve como azcar fermentable. El
indicador de pH es prupura de bromocresol, que se vira a purpura en pH
cercano a 6.8 y amarillo en pH cercano a 5.2.
La inoculacin del Mo se realiza con un asa esteril .El tubo se cubre con 2 a 3
mL de aceite mineral para dismiuir la presencia de oxigeno, esta deficiencia de
oxigeno favorece formacin de acidos por la fermentacin de glucosa, con esto
se crea un medio acido necesario para la formacin de descarboxilasas.
El tubo se incuba a 35c por 24 a 48 hrs despus al examinarlo se obsrva un
cambio en la coloracin.
Tips para un anlisis correcto.
-Comparar los resultados con un tubo control no inoculado para determinar los
cambios ocurridos en el medio.
-Cualquier traza de purpura se considera una prueba positiva el color purpura
puede ir de purpura ligero a purpura oscuro.
Resultados esperados.
Los acidos formados de la fermentacin de glucosa disminuyen el pH del
medio, haciendo que el purpura de bromocresol vire a amarillo. El medio acido
promueve la formacin de descarboxilasas en las bacterias que producen
dichas enzimas.La descarboxilacion genera una alcanizacion del medio debido
a que los producto finales generados elevan el pH del medio, causando que el
purpura de bromocresol vire de color amarillo a purpura(figura 5.9).El color
purpura representa una prueba positiva .Si el medio permanece amarillo y se
inocularon en el medio bacterias con deficiencia en de enzimas descarboxilasa
es una prueba negativa.
Los colores son mostrados
en la figura 5.10 segn
donde se usan los mismos aminocidos.
Desnitrificacion.
Procedimiento y sumario.
La reduccin de nitato a nitrgeno es llamada desnitrificacion , es un proceso
que ocurre en la bacteria que produce la enzima nitrato reductasa.Esta enzima
permite a la bacteria usar el nittrato como aceptor final de electrones en
ausencia de oxigeno, resultando en la producion de gas Nitrogeno.La nitrato
reductasa es producida por ciertas bacterias , como son las pseudomonas
aeuroginosa, pero no por otras como son la Alcaligenes faecalis.
El contenido de culivo de nitrato se usa en un tubo Durham para detectar si un
organismo posee la habilidad para desnitrificar. El cultivo de Ntrato contiene
extracto de carne y

peptonas como sustrato para el


crecimiento, asi como el KNO3 es la
fuente de nitrato.
Para

cultivar se toma de un cultivo aislado una asada .El


tubo se incuba a 35c de 24 a 48 hrs antes
de examinarse.Este
medio tambin se
usa para ver la produccin de gas.
Tips para un anlisis exitoso.
-la presencia de burbujeo indicara la presencia de nitrgeno producto de los
no-fermentadores, ya que los fermentadores solo producen gas debido a la
fermentacin de cabohidratos.
Resultados esperados.
Las bacterias que poseen nitrato reductasa para convertir nitratos en
nitrgeno.Este producto final causan burbujeo en el tubo durham como sea la
presencia de burbujeo en no fermentadores nos indicaran un positivo en la
prueba de desnitrificacion En cambio la ausencia de burbujeo nos indicara una
prueba negativa.Los resultados se muestran en las siguientes imgenes.
Uso de gelatina.

Procedimiento propuesto y sumario.


La gelatina es una
protena que puede ser digerida
por enzimas extracelulares llamadas gelatinasas .El producto final de esta
reaccin son aminocidos que son transportados al interior de la celula para su
uso .Algunas bacterias como la Pseudomonas aeruginasa, estas producen
gelatinasa .La gelatina posee nutrientes como extracto de carne y peptonas
como soporte de crecimiento,en cambio otras bacterias, asi como la suficiente
gelatina (120 g/L) para causar el medio con consitencia de gel.
La inoculacin se da desde un tubo esteril de la cepa aislada se realiza con un
asa recta..El tubo se incuba a 35c por 24 a 48 hrs .El medio es enfriado en un
refrigerador anes de ser examinado.Enfriar el medio es indispensable debido
que la gelatina solo es liquida a temperaturas menores a los 20c.Despues de
enfriar el medio se observa con cuidado el tubo inclinndolo hacia un lado.

Tips para un anlisis exitoso.


-Comparar los resultados con un tubo sin inocular(tubo control)
-No agitar el tubo al transferir al refrigerador; la digestin de la gelatina puede
ocurrir solo en la superficie
-Incubar por das en el caso de haber M.OS degradadores de gelatina tardos.
Resultados esperados.
Si se producen gelatinasas, el medio no gelificara al enfriarse debido a que la
gelatina se rompe en en sus aminocidos invididuales constituyentes.Un medio
liquido despus de enfriar representa un un test positivo para el uso de
gelatina .Un medio gelificado despus de enfriar indicara un test negativo los
resultados son mostrados en las imgenes.
Produccion de
sulfuro de hidrogeno
H2S
Procedimiento propuesto.
La bacteria usa la enzima Cisteina desulforasa para hidrolizar los aminocidos
de la cistena,formando sulfuro de hidrogeno como producto final .El sulfuro de
hidrogeno es un producto final de la reducion bacteriana del tiosulfato.El
sulfuro de hidrogeno es producido por Proteus vulgaris y Salmonella
typhimurium, pero no por Escherichia coli y Shigella flexneri.
El medio SIM, puede usarse para determinar la motilidad asi como la
produccin de Indoles , tambin puede usarse para demostrar la produccin de
sulfuro de hidrogeno.El medio SIM contiene peptonas y extracto de carne como
soporte de crecimiento.Las peptonas contienen el aminocido cistena .Se
incluye Tiosulfato de Sodio en el medio.El sulfato de hierro es la fuente de
hierro usada para detectar la producion de Sulfuro de hidrogeno asi como la
cistena y el tiosulfato de sodio.
Se agrega agar al medio hacindolo semislido.
El agar triple azcar de Hierro y agar azcar kligler,descritos posteriormente en
el capitulo, son usados para demostrar la produccin de sulfuro de Hidrogeno.
Una muestra aislada como un inoculo con un asa recta .El tubo se incuba a
35c de 24 a 48 hrs antes de examinarlo. El medio se observa oscurecido.
Tips para un anlisis exitoso.
-Al leer los resultado para produccin de sulfuro de hidrogeno primero se
determina la produccin de ndol en el mismo tubo.
-Cualquier oscurecimiento del medio se considera un test positivo .
Resultados esperados.
Si la cistena es degradada por efecto de la cistena desulfurasa, o si el
tiosulfato de sodio es reducido,el sulfuro de hidrogeno entonces es producido.El
sulfuro de hidrogeno se combina con sulfato ferroso para formar Sulfuro de
Hierro (FeS), que ennegrece el medio.Un medio oscurecido entonces se
considera un test positivo.Un medio no oscurecido es entonces considerado un
test negativo los resultados se muestran en las imgenes siguientes.
Produccion de indol.
Procedimiento y sumario.
La produccin de ndol es la fraccin l de cuatro pruebas en el test IMViC
usado en la caracterizacin de las bacterias entricas.El aminocido trptofano
es degradado por la enzima triptofanoasa para formar indol, acido pirvico , asi
como amoniaco como productos finales. La triptofanoasa diferencia las
bacterias entricas -indol positivas, como es la Escherichia coli y Proteus
vulgaris, de otras bacterias entricas-indol negativas, como son la Serratia
marcescens y Enterobacter aerogenes.
El medio SIM, es sado para detectar motilidad asi como la produccin de
sulfuro de Hidrogeno, asi como demostrar la produccin de Indol. El medio SIM
contiene peptonas y extracto de carne como soporte de crecimiento.Las
peptonas contienen el aminocido Triptofano. Se agrega agar al medio para
hacerlo semislido.
Se toma un inoculo de una muestra aislada con un asa recta. El tubo se incuba
a 35 c de 24 a 48 hrs .Despues de su incubacin, se agregan 5 gotas de
reactivo de Kovacs se aade a la superficie del agar.El reactivo de Kovacs
contiene alcohol amlico,acido clorhdrico, asi como p-
dimetilaminobenzaldehido , que reacciona con el Indol para generar coloracin
rojiza.
Tips para un anlisis exitoso.
-El test usando reactivo de Kovacs es conocida como prueba organismo indol-
positivo.
-Observe la formacin de color en la capa de alcohol en la superficie del agar.
Resultados esperados.
El aldehdo en el reactivo de Kolvac se combina con el indol generando
coloracin rojiza en la superficie del agar. La aparicin de color rojo nos indica
una prueba positiva de producion de
Indol.
Que
aparezca coloracin rojiza nos
indicara una prueba
negativa.Imagenes de prueba tanto
positiva como negativa se muestran en las
imgenes siguientes.
Reacciones tornasol de leche.
Procedimiento y sumario.
Las bacterias pueden actuar en diversidad de sustratos en la prueba tornasol
de leche, incluyendo la lactosa, Caseina y tornasol, causando una variedad de
reacciones que es especifica para cada especie de bacteria.
Leche tornasol contiene leche desnatada,fuente de lactosa y casena, asi como
tornasol, el indicador de pH oxidacin/reduccin. El tornasol es azul-purpura a
un pH inicial de 6.8 en un medio no inoculado. Montones de colores son posible
en el tornasol despus del crecimiento bacteriano, dependiendo del
microorganismo aislado.
El microorganismo aislado es inoculado en el tubo usando un asa esteril.El tubo
es incubado a 35c por 24 a 48 hrs despus de esto se examina para observar
cambios.
Tips para un anlisis exitoso.
-Comparar los resultados con un tubo control sin inocular para determinar
cuales son los cambios ocurridos en el medio.
-Una incubacin de 24 a 48 hrs tal vez sea necesaria para que ciertas
reacciones se lleve a cabo.
-La reaccin azul alcalina es mas evidente en la parte superior del medio,
debido a que el blanco de la reaccin tornasol de reducccion es mas evidente
al fondo.
Resultados esperados.
La variedad de reacciones posibles en la leche tornasol,son presentados en un
diagrama en las imgenes siguientes:
Fermentacion de lactosa(A):La fermentacin de lactosa libera acido lctico, que
disminuye el pH del medio a 4.5, causando que el tornasol vire rosa. Donde el
color rosa indica la fermentacin de lactosa.
Reaccin alcalina (AlK): La accin de la bacteria en compnentes de la leche
tornasol que contienen nitrgeno, causan la liberacin de amoniaco al medio.
El resultado es que el pH incrementa hasta 8.3 y el tornasol se vuelve azul. Un
color azul indica que se esta llevando a cabo una reaccin alcalina.
Formacion de coagulo(C ) :Debido a la precipitacin de la casena por el acido
lctico o debido a la accin de la enzima renina en la casena bien puede
causar la formacin de un coagulo, que se ve como una masa blanca en el
fondo del tubo.
Reduccion del tornasol(R) : Si el tornasol es usado por un aceptor de electrones
durante la fermentacin de lactosa, este se reduce y se torna en un color
blanco.Un color blanco en el medio bajo la superficie indica la reduccin del
tornasol.
Digestion pptica (D): Las bacterias con enzimas proteolticas digieren la
casena en la superficie del medio, tomando una apariencia acuosa aqu.Esta
reaccin se le conoce como peptonizacion o digestin.

Prueba
de rojo de
metilo.
Procedimiento y sumario.
La prueba de rojo de metilo es la M en la prueba IMViC usada para

caracterizar bacterias entricas.La prueba de rojo de metilo es usada para

identificar bacterias entricas cuyo metabolismo esta basado en el patrn de

glucosa.

Todas las bacterias entricas inicialmente producen acido pirvico por el

metabolismo de glucosa .Algunas bacterias entricas usan de manera

subsecuente en un camino combinado metabolico de acidos donde se

metaboliza el acido pirvico a otros acidos , como es el acido lctico,actico y

acidos formico .Estas bacterias son llamadas rojo de metilo positivo e incluye a

la Escherichia coli y Proteus vulgaris.

Otras bacerias entricas usan de manera subsecuente el camino metabolico de

butilenglicol donde se metaboliza el acido pirvico a productos finales

neutrales.Estas bacterias se les llama rojo de metilo negativas e incluyen

Serratia marcescens y Enterobacter aerogenes.

Rojo de metilo- proskauer(MR-VP)medio, en el test de Voges-Proskauer se usa la

prueba de rojo de metilo.Este medio contiene peptonas como soporte de

crecimiento, asi como glucosa como carbohidrato fermentable.

El microorganismo aislado es cultivo en un tubo ocupando un asa esteril .El

tubo se incuba a 35c de 2 a 5 dias .Despues de la incubacin,2.5 mL del

medio son transferidos a otro tubo.A este se le agregan 5 gotas de indicar de

pH rojo de metilo. El tubo se rota de manera suave entre las palmas de las

manos para dispersar el rojo de metilo.

Tips para un anlisis exitoso.


-Se recomienda como minimo una incubacin de 2,3 a 5 dias para permitir la

subsecuente formacin de los productos finales neutros del acido pirvico.

-No usar mas de 5 gotas de rojo de metilo; usar mas de esta cantidad del

mismo podra impartir color rojo al medio no relacionado al los productos

metablicos finales.

Resultados esperados.

Bacterias entricas son subsecuentemente metabolizados de acido pirvico a

otros acidos que disminuyen el pH al medio a 4.2 .A este pH, el rojo de metilo

lo hace virar a rojo.Entonces el color rojo representa una prueba positiva .Las

bacterias entricas

subsecuentemente

metabolizan el acido pirvico a productos

de finales neutrales que

aumentan el pH del medio a

6.0, a este pH, el rojo de metilo se torna amarillo.Un color amarillo representa

una prueba negativa.Los resultados tanto positivos como negativos son

mostrados en las imgenes siguientes:


Prueba de motilidad.
Procedimiento y sumario.
Siendo que en si la prueba de motilidad no es es un test bioqumico, pero este
se incluye aqu debido a que se realiza como forma de distinguir ciertas
bacterias.La prueba de motilidad entonces determina la presencia flagelo,
apndices externas usadas por la bacteria para moverse .Bacterias con flagelo
son por ejemplo Citrobacter freundii, estos son llamados motiles o con
movimiento, en cambio bacterias como la Staphylococcus epidermis, son
llamados no motiles o sin movimiento.
Medio para test de movilidad, es usado para detectar bacterias con flagelo,
contiene extracto de carne y peptonas como soporte de crecimiento, asi como
agar al 0,5 %.El medio es semislido debido a la baja concentracin de agar,
permitiendo el movimiento de organismos motiles en
el medio. El medio SIM es otro
medio semislido usado para
determinar motilidad bacteriana.
El organismo aislado se logra
transfiriendo un inoculo en
el tubo usando un asa recta.