REPORTE DE PRACTICA

N° 9

“PRUEBAS BIOQUIMICAS:

AILSAMIENTO E IDENTIFICACION DE

ENTEROBACTERIAS”

REYES RAYGOZA ISIS SAMANTHA

4°A

MICROBIOLOGIA

TITULAR: FERNANDEZ SALINAS SILVIA

 Practica 9
Pruebas Bioquímicas: Aislamiento e identificación de enterobacterias patógenas

Objetivos
1. Interpretar algunas de las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana de mayor
utilidad
2. Aplicar la técnica del agotamiento por estrías para la obtención de cultivos puros

INTRODUCCIÓN
Las bacterias captan sustancias necesarias para su multiplicación y liberan productos de
desecho, enzimas, exotoxinas, interactuando con su entorno y con características específicas
que dependen del genotipo de cada bacteria, expresando una serie de reacciones enzimáticas.
Por lo tanto, la liberación de estas enzimas es útil para la identificación y clasificación
bacteriana.

En la recuperación de bacterias patógenas de las heces, implica la separación de los patógenos

de la microbiota normal, mediante el uso de medios selectivos diferenciales y cultivos de
enriquecimiento. Causan gastroenteritis aguda virus, toxinas de estafilococos, Clostridios,
Salmonella, Shigella, vibríos, E coli toxigenica.

FUNDAMENTO:
1. Agar sangre. Es un medio diferencial ya que permite comprobar si la bacteria es capaz
dehemolizar los eritrocitos del medio de cultivo.
Si la hemólisis que se produce es total, se denomina beta-hemólisis; si es parcial alfa-he-
mólisis, y cuando no existe, se habla de hemólisis tipo gamma.
2. Agar McConkey. Es también un medio diferencial, porque contiene lactosa y un
indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azúcar producirán un cambio en
el pH del medio por la liberación de productos ácidos. Como consecuencia sus colonias
aparecerán de color violeta, contrastando con la coloración amarillenta de las colonias de
bacterias incapaces de fermentar la lactosa.
3. Prueba de la citocromo c oxidasa. Los citocromos son proteínas que forman parte de
algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo.
Esta prueba permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carece de citocromo c) del
género Pseudomonas (que posee citocromo c).

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 4. Prueba de la catalasa. Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un
equipo enzimático capaz de neutralizar estas formas tóxicas. La catalasa, que convierte el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La prueba de la catalasa es positiva cuando se
ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con peróxido de hidrógeno al 3 % y
se producen burbujas de oxígeno. Esta prueba se emplea para diferenciar el género
Staphylococcus (catalasa positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo).

5. Agar citrato de Simmons.

Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Únicamente las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo,
utilizarán los fosfatos presentes liberando iones amonio. Esta liberación de iones básicos,
junto con la eliminación del citrato (ácido), produce un cambio de color del indicador de pH,
de verde a azul

6. Agar de Kligler (KIA). Medio diferencial complejo (de color rojo) muy útil, ya que
demuestra varias características enzimáticas de la bacteria. Está compuesto
principalmente por dos azúcares en distinta proporción (glucosa al 0,1 % y lactosa al 1 %),
tiosulfato.
Es útil para estudiar el comportamiento de las bacterias en condiciones de aerobiosis y
anaerobiosis la siembra de este medio se realiza en la superficie del agar aerobiosis y en la
profundidad de este anaerobiosis.

MATERIAL
-Medios de cultivo:

a) Agar McConkey en placa

b) Agar sangre en placa

Pruebas bioquímicas

c) Agar citrato de Simmons en slant

d) Agar de TSI o Kligler (Kligler Iron Agar: KIA) en slant
e) Agar LIA
f) Caldo Urea
g) MIO

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 Reactivos necesarios:

a) Para la prueba de la citocromo c oxidasa: 1 g de N, N, N', N'-diclorohidrato de tetra-

metil-p-fenilendiamonio en 100 ml de H,0
b) Para la prueba de la catalasa
c) Reactivo de Kovacs

Cepas bacterianas: cultivo mixto de enterobacteriaS y cocoS Gram positivo (Staphylo-

coccus o Streptococcus)

METODOLOGÍA
1. Identificar los medios de cultivo que se van a utilizar para pruebas
bioquímicasobservar el color inicial.
2. Marcar cada tubo con el nombre y número de cada equipo.
3. A partir de un cultivo (Mixto) se observan la morfología de las colonias (color textura
forma) y se anotan las características en su manual.
4. De esa colonia identificada, se procede a inocular en la batería de pruebas
bioquímicas antes mencionada. Véase figura 1
5. Coloque frente a usted el mechero y la preparación no muestra que contiene
losmicroorganismos, y el resto del material necesario( portaobjetos, tubos, placas).
6. Tome el asa de siembra y flame el filamento hasta que éste alcance un rojo
incandescente. Enfríelo en la proximidad de la llama (Aprox 10 seg).
7. Si la muestra está en una placa de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesa
de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los
microorganismos.llévela a la proximidad de la llama del mechero.
8. Introduzca el asa de siembra y tome una pequeña muestra del cultivo. si el medio
es líquido, agite ligeramente el tubo y tome una muestra que quedará adherida, al
filamento del asa.
9. Transfiere el inóculo a otro medio de cultivo estéril tomando las mismas
precauciones en su manejo(flameando bocas de tubos, trabajando en la
proximidad de la llama) o bien proceda a preparar un frotis para su tinción.
10. Si la transferencia se va a realizar a un caldo estéril, descargue el inóculo mediante
agitación del asa de siembra. (caldo de la urea)

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11. Si la transferencia se va a realizar en un TUBO INCLINADO, Introduzca el asa con el
inóculo hasta el fondo (por picadura) y siembre en zig zag sobre la superficie.
(KLIGLER, CITRATO LIA)
12. Si la transferencia se va a realizar sobre un medio estéril en una placa de Petri,
deposite el inóculo en un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al
borde. extiende el inóculo formando estrías muy juntas sobre la superficie de una
porción pequeña de la placa.
13. Incube a temperatura adecuada durante el tiempo necesario para que se
desarrollen los microorganismos. (24 a 48 horas)
14. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flaméela de nuevo con el objeto de
esterilizarla
15. Realice la lectura de las pruebas bioquímicas en la siguiente sesión de laboratorio.

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 En la tabla 1 se resumen cuándo se consideran positivos los resultados de las pruebas
descritas.

Tabla 1

Aplicaciones: Actualmente estos métodos están siendo sustituidos por micro pruebas en
sistemas semiautomáticos, que permiten una identificación más rápida y menos laboriosa,
imprescindible en grandes laboratorios (sistema API, etc.).
También se emplean otros métodos no bioquímicos basados en técnicas o en técnicas
biomoleculares (hibridación de ácidos nucleicos, PCR, etc).

RESULTADOS

PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO

CITRATO POSITIVO
MALONATO POSITIVO
UREA NEGATIVO
MIO NEGATIVO
INDOL NEGATIVO
ORNITINA NEGATIVO
TSI (GLUCOSA Y SACAROSA) POSITIVO
GAS NEGATIVO
LIA POSITIVO
MOTILIDAD NEGATIVO
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 NO
NO

NO

NO

NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO

PROBABLEMENTES ES SHIGELLA PNEUMONAE

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1. Anota los cambios de color en las distintas pruebas bioquímicas. Citrato (+), cambio de verde
a azul, malonato (+), cambio de verde a azul, Ornitina (-), cambio de morado a amarillo, TSI
(+), cambio arriba de color amarillo a naranja,
2. Identifica las bacterias analizadas en tu muestra (incluyendo género y especie)

Klebsiella pneumoniae

3. ¿Cómo se observa la fermentación de la glucosa y en qué tubo? Dio positivo, color amarillo,
tubo de TSI
4. ¿Cómo se observa la fermentación de la lactosa?, positivo, color amarilllo, tubo de TSI
5. ¿Cuáles son las diferencias más significativas entre respiración y fermentación en
lasbacterias?
6. ¿Cuál es tu experiencia de aprendizaje? Aprendí sobre como realizar diferentes pruebas
bioquímicas, para poder interpretar que bacteria es debido a que poseen diferentes
características, no todas tendrán citrato positivo, o algunas fermentan glucosa, otras no
poseen indol positivo, eso ayuda a saber que agente es y poder dar un buen diagnostico son
su tratamiento adecuado

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