Ensayos microbiológicos

McFarland

Patrón de turbidez o patrón de McFarland) empleado como referencia al realizar

suspensiones de microorganismos para pruebas de sensibilidad o antibiogramas, como para
demás pruebas donde se requiera conocer el número de unidades formadoras de colonias
(UFC).

Se prepara las concentraciones de los tubos: Se emplea 0.5 ml de 0.048 M de BaCl2

(1,175% BaCl2+2H2O) en 99,5 ml de 0.18 M H2SO4 (1% v/v) con agitación constante.
Rotulamos todos los tubos antes de hacer las disoluciones, con 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 y
10.
1 - 0,2ml de BaCl2 y 24,75ml de H2SO4
2 - 0,5ml de BaCl2 y 24,5ml de H2SO4
3 - 0,75ml de BaCl2 y 24,25ml de H2SO4
4 - 1ml de BaCl2 y 24ml de H2SO4
5 - 1,25ml de BaCl2 y 23,75ml de H2SO4
6 - 1,5ml de BaCl2 y 23,5ml de H2SO4
7 - 1,75ml de BaCl2 y 23,25ml de H2SO4
8 - 2ml de BaCl2 y 23ml de H2SO4
9 - 2,25ml de BaCl2 y 22,75ml de H2SO4
10 - 2,5ml de BaCl2 y 22,5ml de H2SO4

Alícuotas se distribuyen en tubos con tapón de rosca y se guardan en la oscuridad a

temperatura ambiente.

Se prepara el inoculo: Coger de 3 a 5 colonias iguales de la placa de cultivo de 18 a 24

horas y sembrarlas en 5 ml de un medio líquido (algún agar nutritivo) e incubar en la estufa
a 35ºC durante 2 a 6 horas hasta conseguir o superar una turbidez del 0.5 de la escala de
MacFarland.

Si la turbidez es superior se realiza el ajuste necesario con suero salino estéril, se obtiene 11
tubos con diferente turbidez.

Se determina el inóculo por densitometría

https://www.microkit.es/fichas/MAC-FARLAND-PATRONES.pdf

Pruebas IMViC (indol, MR-VP, pruebas de citrato)

1) La prueba de Indol se realiza con tubos que contienen medio acuoso de peptona,
inoculados con cultivo bacteriano. Después de la incubación, se agregaron 0,5 ml del
reactivo de Kovac a cada tubo bacteriano en crecimiento, sacudir suavemente y
observar.
Fundamento: Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de romper y
desaminar el triptófano provocando la síntesis de Indol . Aparece el color rojo oscuro cuando
el indol liberado reacciona con el 4-dimetilaminobenzaldehído. La producción de indol es una
característica importante en la identificación de muchos microorganismos, especialmente E.
coli (+)

Reactivos:
- Agar nutritivo o caldo: caldo Urea Indol, agua
Peptonada, medio SIM, caldo de Cultivo
Triptófano, medio MIO , medio Indol Nitrito,
caldo Lauril Sulfato Cromogénico.
- Rvo. de Kovac
- Tubos con tapa rosca
- Cultivo bacteriano.
Observación:
Positivo: color rojo en la interfase (Anillo) del
reactivo y el medio de cultivo.
Negativo: el color del reactivo revelador
permanece incoloro-amarillento.

2) La prueba MR-VP se realiza mediante la inoculación de muestras de cultivo

bacteriano en tubos que contenían el medio MR-VP. Después de la incubación, el
medio de cultivo de crecimiento se divide en dos volúmenes iguales y se coloca en
dos tubos, se agrega 0,5 ml de reactivo rojo de metilo a las bacterias de crecimiento
del primer tubo, se observa un cambio de color en el medio. Se añade 0,6 ml de
reactivo VP-1(alfa-naftol 5%) y 0,2 ml de VP-2 (KOH 40%) al crecimiento bacteriano
del segundo tubo y se agita, se observa un cambio de color en el medio.
Fundamento: En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios
para desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
La diferencia en el metabolismo bacteriano, es reconocida por la adición de un
indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la
adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos
finales neutros. La coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo
el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/
upl_6070751064820.pdf

Reactivos:
-Medio nutritivo: Pluripeptona
-Rvo: rojo de metilo y el alfa
naftol/KOH
- Tubos con tapa rosca
- Cultivo bacteriano.
Observación:
Prueba del rojo de metilo:
Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.
Prueba de Voges Proskauer:
Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de
una completa agitación del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.
 3) Prueba de citrato se realiza utilizando tubos que contiene el medio de citrato de
Simmons que se inoculan con cultivo bacteriano mediante estrías inclinadas.
Después de incubar, se observa un cambio en el color del indicador en el medio.
Fundamento: contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono
y de nitrógeno respectivamente, y azul de bromotimol, como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará
una fuerte alcalinización del medio que será aparente por un cambio de color del
indicador de pH.

Reactivos: Observación:
- Medio agar citrato Simmons - Positivo: Intenso color azul en el pico de flauta.
-Cultivo bacteriano. - Negativo: Ausencia de crecimiento y permanencia del color verde
-Tubos con tapa rosca del medio de cultivo.

Pruebas de producción de enzimas: (pruebas de ureasa, catalasa y oxidasa)

A) Prueba de ureasa se realiza utilizando tubos que contienen el medio de urea,

inoculados por estrías inclinadas de cultivo bacteriano, después de la incubación de
los tubos. Observar.

Fundamento: capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando una

molécula de dióxido de carbono y dos moléculas de amoniaco por acción de la
enzima ureasa. El amoniaco hará variar el color del indicador de amarillo a rojo.

Procedimiento: Inocular el medio de cultivo mediante estría en la superficie inclinada

e incubara 37 ºC durante 24 horas. Para Pseudomona aeruginosa
 Reactivo: Observación:
-Medio de urea Positivo: Medio de cultivo color fucsia
-Asa de siembra
- Cultivo bacteriano.

B) Prueba de catalasa se realiza colocando una gota de agua oxigenada 30 % en un

portaobjetos transparente y seco, y luego se mezcla con una colonia de bacterias
(con asa de siembra) o 1 ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo de agar
densamente inoculado.

Fundamento: Comprobar presencia de la enzima catalasa que se encuentra en la

mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen el
citocromo oxidasa. La principal excepción son los estreptococos (Streptococcus)

Reactivo: Observación:
-1 ml de H2O2 3% / Gotas de H2O2 30% Positivo: Formación inmediata de
-Portaobjeto burbujas
-Asa de siembra
- Cultivo bacteriano.

C) Prueba de oxidasa se realiza agregando unas pocas gotas de solución de reactivo de

oxidasa en papel de filtro, luego las colonias se transfieren mediante un aplicador y
se colocan en el papel de filtro. Después de esperar 10-60 seg. Observar.
Para identificar todas las especies de Neisseria (+) y diferenciar Pseudomonas de los
miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
Fundamento: La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
citocromo oxidasa. Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de
transporte de electrones en la respiración aeróbica, transfiriendo electrones al
oxígeno, con la formación de agua. Presencia de oxidasa va ligada a la producción
de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como
consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

Reactivo: Observación:
- 1% de diclorhidrato de Positivo: Tiñe color lavanda que vira gradualmente
 tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs) a púrpura-negruzco intenso
- Papel filtro 3x3 cm
- Gotero
- Cultivo bacteriano.

Pruebas de presunción de coli

Se incubaron en caldo MacConkey a 37°C durante 24 horas, tres juegos, cada uno de los
cuales constaba de tres tubos que contenían 10 ml, 1 ml y 0,1 ml de la muestra. Los
números más probables (MPN/1) se determinaron a partir de la tabla de McGrady.

Para la prueba de Eijkman, los tubos de presunción coli positivos se inocularon en caldo
verde brillante con bilis al 2% y se observó la producción de ácido y gas a 44°C después de
48 horas. Para el recuento total, se realiza diluciones en serie en solución salina estéril y se
sembraron partes alícuotas en placas de Petri cubiertas con 20 ml de agar de recuento en
placa ISO fundido estéril (Difco). Las placas se corrieron por triplicado y la duración de la
incubación fue de 48 horas a 37°C.

METODO DE DIFUSION DE DISCO

Se vierte agar Muller Hinton en placas Petri estériles e inoculados con los cultivos de prueba
frescos durante la noche usando algodón hisopos.

Se impregnan discos estériles de 6 mm de ancho con (10, 15 y 20 mL). La capa superior del
disco preparado se introduce en la placa de agar sembrado.

Las placas se incuban durante la noche a 37 °C. La actividad antibacteriana se evalúa y

compara midiendo zonas de inhibición que formado alrededor del disco. Los valores medios
se calculan por tres veces el experimento.

Técnica de fermentación en tubos múltiple

https://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=4728216&fecha=20/04/1982&print=true

Para usar la técnica del NMP utilizar series de tubos, los cuales constan de tres diluciones
por lo menos 10.0 cm3, 1.0 cm3, y 0.1 cm3 o bien 1.0 cm3 y 0.01 cm3, por cada dilución
debe hacer 3 ó 5 tubos.

Prueba presuntiva para clasificar coliformes totales y fecales.

Homogeneizar la muestra agitando 30 veces e inocular una serie de tubos de fermentación

que tengan caldo lactosado o caldo lauril triptosa con cantidades apropiadas de la muestra
que se va a analizar (múltiplos o submúltiplos de las diluciones de 10.0 cm3, 1.0 cm3 y 0.1
cm3). Incubar los tubos de fermentación inoculados 308 K más menos 0.5 K (35 más menos
0.5°C). Examinar cada tubo a las 24 h más menos 2 horas.
Los tubos que presenten formación de gas se consideran positivos. Incubar de nuevo los
tubos que no presentan formación de gas otras 24 h más menos 2 horas.

- La formación de gas dentro de 48 h más menos 3 horas de incubación total,

constituye una prueba presuntiva positiva y da un indicio de la presencia de
coliformes.
- La ausencia de gas al final de 48 h más menos 3 horas de incubación total indica una
prueba negativa, es decir, ausencia de coliformes y por lo tanto el análisis queda
concluido.

Prueba confirmativa para coliformes totales.

Resembrar los tubos que resulten positivos de la prueba presuntiva, tomando de una a tres
veces con el asa de inoculación en caldo lactosado verde brillante de bilis e incubar a 308 k
más menos 0.5 K (35°C más menos 0.5°C).

Examinar cada tubo a las 24 h más menos 2 horas, si hay tubos que presenten formación de
gas se consideran positivos y los tubos que no presenten formación de gas, incubar otras 24
h más menos 2 horas.

- La formación de gas dentro de 48 h más menos 3 horas de incubación total, constituye una
prueba confirmativa de la presencia de coliformes totales.

- La ausencia de gas dentro de 48 h más menos 3 horas, de incubación total constituye una
prueba de la ausencia de coliformes totales.

Prueba confirmativa para coliformes fecales.

- De los tubos que resulten positivos en la prueba presuntiva en el punto anterior

inocular usando una asa de una a tres veces en tubos de fermentación con caldo
ácido bórico (6.9) o medio E. C. e incubar a 316 K más menos 0.5 K (43°C más
menos 0.5°C) y 317.5 K más menos 0.5 K (44.5°C más menos 0.5°C)
respectivamente en baño maría durante 48 más menos 3 horas.
- La formación de gas dentro de 48 h más menos 3 horas de incubación total
constituye una prueba confirmativa de la presencia de coliformes fecales.
- La ausencia de gas dentro de 48 h más menos 3 horas, de incubació total constituye
una prueba de la ausencia de coliformes fecales.

NUMERO MAXIMO PROBABLE

https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35732/tema_6.pdf

Medios selectivos

Agar EMB
Agar Mac Conkey

Agar sangre

Se incuban a 37° C durante 24 horas, se verifican las morfologías de las colonias.

Tinción de Gram

Ensayo de fluorescencia estándar

Basado en el kit de viabilidad LIVE/DEAD® BacLightTM. Las condiciones del agua se varía
modificando la concentración de cloruro de sodio (NaCl) y un estándar de materia orgánica
natural: el ácido húmico del río Suwannee (SRHA-NOM). El ensayo LIVE/DEAD consta de
dos colorantes: SYTO® 9, una tinción de ácido nucleico verde fluorescente que marca todas
las células de una población, y yoduro de propidio, una tinción de ácido nucleico rojo
fluorescente que solo penetra en las células con membranas dañadas (también reduce la
SYTO 9 tinción de fluorescencia).

Kit de citotoxicidad/viabilidad LIVE/DEAD discrimina rápidamente las células vivas de las

muertas mediante la tinción simultánea con calceína AM verde fluorescente para indicar
actividad de esterasa intracelular y homodímero-1 de etidio rojo fluorescente para indicar la
pérdida de integridad de la membrana plasmática.