Guía de Laboratorio

PRÁCTICA DE LABORATORIO EXTRACCIÓN DE ADN

MÓDULO 4 PRÁCTICA DE LABORATORIO EXTRACCIÓN DE ADN

Las técnicas derivadas de la biología molecular o ingeniería genética como Reacción

en Cadena de la Polimerasa (PCR), clonación, hibridación y secuenciación, se utilizan
de forma creciente tanto para fines básicos como aplicados. En el campo dela salud,
las aplicaciones de estas tecnologías han hecho posible la comprensión de procesos
asociados a mecanismos de enfermedades genéticas e infecciosas, respuesta
inmune, desarrollo de células cancerosas y resistencia a antibióticos, entre otros
procesos celulares. El análisis de la secuencia de los ácidos nucleicos así́ como el
desarrollo tecnológico de sus procesos, han sido la base para el diseñode vacunas,
producción de fármacos, mejoramiento de la calidad nutricional de especies
vegetales y animales, resistencia vegetal a plagas, control de enfermedades
parasitarias, prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades.

La aplicación de las técnicas moleculares anteriormente mencionadas inicia con la

extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducción
depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro. Ahora, para el
estudio y manipulación de los ácidos nucleicos, estos deben ser aislados de la célula
en condiciones adecuadas, para que conserven su integridad y propiedades
inherentes (tamaño, secuencia, etc.). Este proceso puede ser realizado de manera
manual en el laboratorio o, automatizada utilizando sistemas robóticos.
INTRODUCCIÓN La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa
en las características bioquímicas de la molécula de ADN. A largo del tiempo se ha
diseñado diferentes protocolos con la finalidad de obtener calidad y cantidad de ADN
adecuados, así́ como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que
dificulten el tratamiento posterior de la molécula. En general los protocolos
tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogenización del tejido, lisis
celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN. En
general la lisis celular puede realizarse empleando un medio hipotónico en algunos
casos esta etapa es simultánea con la preparación de la muestra por homogenización
mecánica. El lisado celular también puede ser sometido a digestión enzimática (ej.:
proteinasa K), tratamiento con detergentes (ej.: SDS) o ácidos (ej.: HCl), para su
solubilización o eliminación de ciertas macromoléculas aún presentes en la muestra.
Después de centrifugar para descartar las células intactas, organelas y restos de
membranas, el sobrenadante que contiene los ácidos nucleicos solubilizados, es
tratado con agentes químicos orgánicos o inorgánicos como fenol, mezclas de
cloroformo-alcohol isoamílico o una solución concentrada de sales (ej.: cloruro de
sodio 5M o acetato de amonio 8M) que permite separar las proteínas al
desnaturalizarlas. El ADN soluble en la fase acuosa se precipita después de la adición
de etanol absoluto y a través de centrifugación es colectado y
 concentrado formando un pequeño botón. Después de ser secado y disuelto en un
buffer apropiado (Tris-HCl/EDTA (TE)), el ADN puede ser visualizado en un gel de
agarosa después de la electroforesis horizontal y de la tinción como un compuesto
que emite fluorescencia bajo luz ultravioleta(ej.: EZ visión).

Existen diversos métodos para estimar la concentración de los ácidos nucleicos

después de su extracción. La cuantificación del ADN se realizará mediante
espectrofotometría utilizando el rango de luz UV. Debido a los anillos presentes en
las bases nitrogenadas del ADN, esta molécula tiene absorbancia máxima a 260 nm.
Para determinar pureza, se utiliza la razón de ADN/proteínas. La abundancia de
proteínas residuales en el extracto se determina midiendo absorbancia a 280 nm. Un
buen ADN (calidad y pureza) es aquel cuyo A260/A280 es de 1.8 a 2.0. Si el ADN o
ARN es puro (no contiene cantidades significativas de contaminantes como
proteínas, fenol, agarosa o incluso otros ácidos nucleicos), su medición mediante
espectrofotometría es la metodología más adecuada. Pero si por lo contrario, la
cantidad de ácidos nucleicos es reducida, o si la muestra contiene altas cantidades
de impurezas, la estimación de la concentración puede llevarse a cabo mediante la
intensidad de fluorescencia emitida por compuestos como el bromuro de etidio
(colorante fluorescente).

OBJETIVOS 1. Reconocer las bases bioquímicas y moleculares de las técnicas de

ESPECÍFICOS DE extracción, separación, visualización y cuantificación de ácidos nucleicos.
LA SESIÓN DE 2. Valorar la utilidad de las técnicas de análisis y estudio del genoma y su
LA PRÁCTICA importancia en el diagnóstico de enfermedades de origen genético o
DE infeccioso.
LABORATORIO

MOMENTO DE CONTEXTO

Previo a la sesión de laboratorio se sugiere a cada estudiante de forma independiente:

● Realice la lectura de la fundamentación teórica, revisando el pdf Extracción y purificación del

ADN. De ella se hará un quiz de comprobación de lectura. También puede revisar el siguiente
link interactivo de extracción de ADN virtual

Preguntas previas orientadoras

1. Qué técnicas bioquímicas y moleculares se pueden emplear para el diagnóstico de

enfermedades genéticas o de enfermedades infecciosas? Mencione 6 ejemplos
 2. ¿Cuál es el fundamento fisicoquímico de los siguientes reactivos empleados en el proceso de
extracción del ADN: Detergente, Sales, proteinasa K, alcoholes y Fenol-cloroformo?
3. Identifique los métodos de estimación de concentración y pureza del ADN.

● Elabore un diagrama de flujo que describa el procedimiento experimental de la práctica. Para

esto puede usar como guía el Modelo para diagrama de flujo. Debe estar elaborado a mano y
con buena presentación.
El diagrama de flujo es requisito indispensable para permitir el ingreso al laboratorio
Además recuerde cumplir con las normas de seguridad:
● Bata de laboratorio
● Zapatos cerrados que no sean de tela ni lona (que si se derrama un líquido en ellos fluya, no se
absorba)
● Gafas de laboratorio
● Cabello recogido
● No joyas (ninguna: aretes, pulseras, cadenas, piercings, anillos, etc)
● No maquillaje

MOMENTO DE EXPERIENCIA

En esta sección usted encontrará la descripción de la actividad de experiencia preparada por los docentes
para que se realice en el laboratorio, con esta información es que usted debe preparar su diagrama de
flujo.

Recuerde que después de permitido su ingreso al laboratorio, se realizará un quiz de comprobación de

lectura de la fundamentación teórica.

MATERIALES Y REACTIVOS DE LABORATORIO

Extracción del ADN

Reactivos y Materiales Cantidad por
grupo

Solución de lisis: NaCl al 1,5% y bicarbonato sódico al 5% en agua destilada 5 mL

(alicuotado en tubo de ensayo de boca ancha y con tapa)

Detergente líquido lavaloza 5% (alicuotado en tubo de ensayo de boca ancha 1 mL

y con tapa)

Etanol al 96% frío (alicuotado en tubo de ensayo de boca ancha y con tapa) 4 mL

Etanol al 70% (alicuotado en un vial de microcentrífuga de 1,5 mL) 500 μL

Buffer TE (Tris HCl 10mM pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0) 1 mL

 Beaker de 50 mL 1

Varilla de vidrio 1

Pipeta graduada de 5 mL y propipeta 1

Pipeta Pasteur plástica de 5 mL 1

Pipeta Pasteur de vidrio 1

Vortex 1

Tubo o vial de microcentrífuga de 1,5 mL 2

Microcentrífuga 1

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Extracción del ADN de células epiteliales de la mucosa bucal

NOTA IMPORTANTE: La extracción se realizará con células del epitelio bucal de un estudiante de cada
grupo que haya cepillado sus dientes previo a la toma de muestras. Es conveniente enjuagarse la boca
varias veces antes de hacer la extracción de la muestra, para eliminar los posibles restos de comida que
puedan interferir en el resultado.

1. Para colectar las células epiteliales de la mucosa bucal enjuague la boca, por uno o dos
minutos, con la solución de lisis que se encuentra en el tubo de ensayo marcado para tal fin. Para
optimizar la recolección de células, frote la lengua en las paredes de la boca varias veces durante el
enjuague.

2. Vierta la solución en un beaker y añada dos gotas de detergente líquido. Mezcle con la varilla
de vidrio para homogenizar el detergente por 2 min. Se debe mezclar suavemente con el fin de evitar
la formación de espuma. En este paso los varios cientos de células del tejido epitelial de la mucosa
bucal existentes se romperán y se liberará el ADN del núcleo.

3. Con la pipeta pasteur transfiera 2 mL de la solución del lisado celular, al tubo de ensayo que
contenía la solución de lisis. Cierre muy bien la tapa y agite con ayuda del vortex por 30 segundos.

4. Deje reposar la solución por 5 minutos sobre la mesa a temperatura ambiente, para permitir
que complete la lisis nuclear.

5. Con el tubo del lisado celular inclinado en un ángulo 45º y utilizando una pipeta graduada y
una propipeta, vierta lentamente y por las paredes del tubo 4 mL de Etanol 96% frío. (El metanol
o isopropanol al 96%, también serviría).
6. Observe cuidadosamente como se forman dos fases o capas. Determine el punto en que se
juntan las dos capas. Quizás vea cómo se forman hilos de ADN, como filamentos nubosos que se
estiran hacia la capa superior (etanol). Se observa que aparece una hilera de burbujas más pequeñas
que las de champán, unidas por un hilillo casi imperceptible, esponjoso, blanquecino.
¡Ahí está el ADN precipitado! (se formó una sal de ADN)

7. Introduzca la punta de la pipeta pasteur de vidrio hasta justo debajo de la separación entre
el alcohol y la solución de lisis. Mueva la pipeta en forma circular (hacia delante y hacia atrás) y poco
a poco se irán enrollando los fragmentos de ADN de mayor tamaño.

8. Sumerja el ADN extraído (que tiene apariencia viscosa y color blanquecino) en un vial con
500 μL de etanol al 70% para su rehidratación

9. Centrifugue por 5 minutos a 12000 rpm en microcentrífuga el ADN extraído contenido en el

vial. Elimine el sobrenadante y deje secar por 20 minutos a temperatura ambiente.

10. Resuspenda el ADN en 100 μl de solución de Tris-HCl/EDTA (TE).

Cuantificación de ADN por espectrofotometría.

1. Limpie los cabezales del nanodrop (espectofotometro) con agua desionizada estéril, e inicie
el programa dando clic a NanoDropTM 2000 y seleccione la aplicación ‘Ácidos nucleicos’.

2. Tome una micropipeta y pipetee 2 μl del agua o solvente usado para diluir el DNA (i.e. blank)
en el pedestal, baje el cabezal superior para formar la columna de solución.

3. Haga clic en ‘Blank’. Espere a que el equipo haga la medida y la tome como línea base
(blanco) para las siguientes mediciones.

4. Levante el cabezal superior y limpie la muestra tanto del cabezal superior como del pedestal
con un papel toalla.

5. Repita el paso 3 para asegurarse que el equipo tomó la muestra de referencia o ´blank´
adecuadamente.

6. Haga clic en ´Measure´. Espere a que el equipo haga la medida. Si la medida es cercana 0.0
ng/μl continúe con el paso 10. Si no lo es, repita el procedimiento desde el paso 4.

7. Levante el cabezal superior y limpie la muestra tanto del cabezal superior como del pedestal
con un papel toalla.

8. Tome 2 μL de la muestra de DNA a medir y pipeteelos en el pedestal, baje el cabezal superior.

9. Haga clic en ´Measure´. Espere a que el equipo haga la medida.

 10. Registre las lecturas de la Densidad Óptica (D.O.) a 260nm y a 280nm, y el radio 260/280 de
todas las muestras de ADN obtenidas durante la práctica de laboratorio.

NOTA IMPORTANTE: Las bases purinas y pirimidinas absorben fuertemente en la luz ultravioleta a
260nm, es por ello que la lectura a 260 nm permite calcular la concentración del ADN en la muestra.
Una unidad de D.O. a 260nm igual a 1,0, corresponde aproximadamente a 50 µg/mL de ADN de doble
cadena, a 33 µg/mL de ADN de cadena sencilla, a 20-30 µg/mL de oligonucleótidos entre 20 a 40
bases y a 40 µg/mL de RNA. La relación entre las medidas a 260nm y 280nm (D.O.260:D.O.280)
proporciona un estimado de la pureza de la muestra. Las preparaciones puras de ADN deben tener
un valor D.O.260:D.O.280 de 1,8 a 2. Valores por debajo de este rango son un indicativo de
contaminación con proteínas e indica la necesidad de una nueva extracción o precipitación de
proteínas con isopropanol.

MOMENTO DE REFLEXIÓN

En esta sección usted encuentra una reflexión guiada hacia el análisis de datos y conclusiones que
debería hacerse de los experimentos en la práctica de laboratorio.

1. Para los resultados: Registre los datos obtenidos durante la cuantificación de los 5 grupos de su
laboratorio en una tabla, cuantifique el valor de pureza y posteriormente grafique estos datos
empleando un diagrama de barras. Para la interpretación de los datos, compare y analice los
valores de pureza de las muestras extraídas con el valor teórico de pureza y el valor de una
muestra problema.

2. Para la discusión: De manera fundamentada (apoyado en los principios fisicoquímicos de los

reactivos empleados para la extracción de ADN), analice los resultados obtenidos en la extracción
y cuantificación. Justifique la razón de los resultados obtenidos en la práctica. Este análisis debe
conducir de manera congruente a las conclusiones.
3. Resuelva la siguiente pregunta de análisis: ¿Cuál es la relación entre las medidas obtenidas a
260nm y 280nm con la pureza de una muestra de ADN?

MOMENTO DE ACCIÓN Y EVALUACIÓN

Ocho días calendario, después de realizada la práctica, debe enviarse el informe grupal de laboratorio.