Facultad de Ciencias Químicas

Laboratorio de Biotecnología

Práctica No. 1: Extracción y purificación de ADN

Alejandra Baroza Ortiz

Fernando Ortiz Velázquez

Jimena Sigala Garcia

Fecha de entrega: 15 de agosto de 2023

Dra. Alicia Rivera Noriega

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Objetivos

- Comparar dos métodos de extracción de DNA de levaduras.

- Cuantificar y evaluar el DNA extraído y concluir con qué metodología se obtuvo un

mejor rendimiento y pureza del producto.

Guía de estudio

1. Metodología general de aislamiento de DNA de levaduras (explicar la función de

cada unos de los reactivos utilizados en la técnica)

Los métodos convencionales para la preparación de DNA a partir de células de

levadura utilizan la degradación enzimática o el batido con perlas de vidrio,
generalmente seguido de la lisis de las células con detergente y la extracción de
DNA con fenol-cloroformo.
La extracción orgánica de DNA en levaduras implica la adición en serie de varios
productos químicos. Primero se agrega dodecilsulfato de sodio (SDS) y proteinasa K
para romper las membranas celulares y descomponer las proteínas que protegen las
moléculas de ADN mientras están en los cromosomas. Luego se agrega una mezcla
de fenol/cloroformo para separar las proteínas del ADN. El ADN es más soluble en la
porción acuosa de la mezcla orgánico-acuosa. Cuando se centrifuga, las proteínas
no deseadas y los desechos celulares se separan de la fase acuosa y las moléculas
de ADN de doble cadena se pueden transferir limpiamente para su análisis.

2. Extracción de DNA por métodos físicos (perlas de vidrio)

Bead-beating es un método de ruptura mecánica que se realiza antes de la

extracción de ADN estándar. En este paso, se agregan perlas de cerámica o vidrio al
tubo que contiene muestras microbianas. A esto le sigue una agitación de moderada
a alta velocidad, lo que provoca colisiones entre las perlas y las muestras.

Las perlas de captura de ADN Monarch se proporcionan como un componente de

los kits de extracción de ADN. Las perlas especializadas tienen 4 mm de diámetro y
están hechas de vidrio de borosilicato y se han optimizado para capturar ADN de
alto peso molecular en los flujos de trabajo de extracción de ADN. El uso de perlas
de vidrio grandes en el flujo de trabajo de extracción de ADN permite un lavado
rápido y eficiente sin necesidad de pasos de secado. La elución de las perlas es
rápida y completa; se recupera todo o casi todo el ADN. El ADN eluido de las perlas
también es fácil de disolver y está listo para usar en mucho menos tiempo que otros
métodos de extracción de ADN.

3. Extracción de ADN método enzimático (liticasa)

La obtención de ADN a partir de materiales biológicos requiere la homogeneización

de los tejidos, en su caso, el lisado de células y la inactivación de las nucleasas
celulares que podrían digerir el ADN. Esto asegura que la cantidad de ADN intacto
obtenido sea la máxima. La homogeneización y la lisis celular deben ser lo
suficientemente fuertes para romper el tejido, la pared y las membranas celulares,
suelen ser suave para preservar el ADN. Uno de los procesos más comunes es la

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 digestión enzimática con enzimas hidrolíticas para romper la pared celular, como lo
son la liticasa (rompe la pared celular de levaduras y hongos) u otras como es la
lisozima, mutanolisina, zimolasa o proteinasa K. A pesar de que su costo es elevado,
son los más eficaces para romper tejidos compactos y células con paredes celulares
resistentes.

La liticasa por lo tanto se podría definir como una enzima que se usa en la
extracción de microsomas, ya que está degrada la pared celular de las levaduras y
de esta forma ocurre un rompimiento suave de las células y es usada en el proceso
de extracción de los microsomas las cuales son formaciones vesiculares formadas
por el retículo endoplásmico (Álfaro, 2019).

4. Método de purificación de DNA y su fundamento

Este método combina la separación de biomoléculas de acuerdo a su polaridad

mediante extracción y la precipitación de biomoléculas mediante la adición de
alcoholes siendo esencial maximizar la cantidad y calidad del ADN recuperado.

● Extracción con solventes para eliminar contaminantes como lo son las nucleasas (se
liberan al lisar las células y degradan los ácidos nucleicos) con la combinación de
fenol y cloroformo. Este método es seguro para el personal técnico y tiene un alto
grado de pureza.

● Precipitación de los ácidos nucleicos con isopropanol o etanol, dado que el ADN es
insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El ADN precipitado forma unas
finas hebras blancas, mientras que el resto de las sustancias permanecen disueltas.
A diferencia del método anterior este se recomienda su manipulación en campanas
de extracción debido a que son catalogadas sustancias tóxicas.

Su fundamento se basa en la extracción referente al aislamiento y purificación

(separación de ácidos nucleicos) de moléculas de ADN específicamente en las
características fisicoquímicas de la molécula. Es decir mediante la adición de fenol o
cloroformo se da lugar a la aparición de 2 fases: una fase acuosa superior que
contiene a los ácidos nucleicos y una fase orgánica que contiene las proteínas
disueltas en fenol el cual debe tener un pH=7-8. Posteriormente se precipita el ADN
con isopropanol o etanol al 70% para la eliminación de sales u otros solutos que
podrían aún estar presentes en la muestra. Por último se resuspende en un tampón
apropiado.

A grandes rasgos, una extracción y purificación de ácidos nucleicos exitosa depende

de la eficacia de la lisis celular, de la correcta eliminación de otras macromoléculas
(proteínas y lípidos), así como el uso de inhibidores enzimáticos que eviten la
degradación celular durante el proceso y la rapidez con la que se realice el
procedimiento.

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Diagrama de flujo

Bibliografía

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