Manual de Laboratorio Bioquímica II

Práctica Nº 7
Extracción de ADN y electroforesis en geles de agarosa
Completar la siguiente tabla y elegir un color de texto por estudiante (personal) para trabajar el formato compartido
con su equipo (El formato estará disponible en Google Drive para que sea trabajado por el equipo en tiempo real)

Mesa

Integrantes 
Florangel Russed Robles Calixtro 

Cueva Huaman, Yovana

Milagros Nuñez Paulino 

Ore Ore Andrea 

Alvites Huamani Brigitt Vanessa 

I. INTRODUCCION

Toda la información genética contenida en cada célula (​genoma)​, reside en la larga macromolécula enrollada de
DNA. El mensaje que lleva la información se expresa o procesa de dos maneras básicas: por duplicación exacta del
DNA para que pueda ser transferido a la célula hija durante la división celular, y por expresión almacenada,
fabricando primero RNA y luego las proteínas, herramientas moleculares que realizan las funciones de la célula. En
esta forma indirecta, el DNA ejerce sus efectos fundamentales, al controlar las miles de reacciones químicas que
ocurren en una célula.

El lenguaje para almacenar la información en el DNA consiste en un alfabeto de cuatro letras: A, T, G y C. El formato
para almacenarla es una secuencia lineal de los nucleótidos en DNA que varía en tamaño y secuencia con cada
especie. Por ejemplo, el genoma humano completo tiene aprox 1.8 m de longitud y contiene un número estimado de
3 mil millones de pares de nucleótidos. Una molécula de DNA de ​E. coli mide cerca de 2 µm de largo y contiene
alrededor de 4 millones de pares de nucleótidos.

Ahora bien, ¿Por qué se eligió al DNA para la función más importante en la célula?, se ha encontrado que la
molécula de DNA es particularmente estable en condiciones tanto intra como extracelulares. Los enlaces covalentes
que unen a cada subunidad de nucleótido son químicamente estables y no son susceptibles de experimentar ruptura

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hidrolítica en el medio acuoso de la célula. Esto establece una forma segura y duradera de almacenamiento de la
información genética, que no debe alterarse ni dañarse de generación en generación.

Los bioquímicos descubrieron que el DNA se puede extraer de especímenes de museo y muestras arqueológicas de
varios millones de años. Se han detectado y analizado muestras de DNA de pieles de animales de museo (de 140
años), de una momia egipcia (de 5000 años), de un cerebro humano de 8000 años, de una planta de 45 000 años,
de huesos de un dinosaurio de 65 millones de años y de un escarabajo conservado en ámbar de 120 millones de
años. Las moléculas de DNA aislado de muestras antiguas son de menor tamaño y tienen modificaciones químicas
por los procesos de la oxidación natural. No obstante, con el empleo de la técnica denominada ​reacción en cadena 
de la polimerasa​, es posible reconstruir fielmente el DNA y amplificar la producción de moléculas idénticas.

Por tanto, la extracción y purificación de ADN de alta calidad es un prerrequisito para su uso en técnicas de biología
molecular como PCR, fingerprinting, clonaje, secuenciación, digestión con enzimas de restricción, etc. Es
conveniente obtener una buena cantidad de ADN cuando la muestra lo permite y que éste se encuentre lo más
limpio y puro posible, libre de contaminantes como proteínas básicas, ARN, carbohidratos, etc., que pueden
bloquear la acción del tratamiento al que someteremos a dicho ADN. Por ejemplo, las proteínas básicas pueden
inhibir la entrada de ADN en el gel de electroforesis.

Pasos para la obtención de ADN:

1. Lisis celular

Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas
celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en
un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por
ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de
lisis figuran los siguientes:

o Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);

o Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);

o Digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una
misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes
que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células
se eliminan fácilmente por precipitación.

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2. Purificación

A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por
ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas, aunque esta
práctica se viene sustituyendo por técnicas alternativas, ya que dichos solventes orgánicos son muy tóxicos.

3. Precipitación

Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de
ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la
precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas
(precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH.

La verificación de la calidad e integridad del ADN se puede realizar mediante espectrofotometría y electroforesis en
geles de agarosa con posterior tinción con bromuro de etidio, respectivamente.

II. OBJETIVOS

● Simular la manipulación de los insumos y los reactivos que se utilizan convencionalmente para la extracción de
ADN.
● Evaluar la calidad del ADN extraído mediante espectrofotometría.
● Brindar una visión general de la electroforesis de los ácidos nucleicos.
● Caracterizar los ácidos nucleicos usando electroforesis en geles de agarosa.

III. MATERIALES​:

● Vídeo extracción de ADN (​https://www.youtube.com/watch?v=58ByqAmlF7o​)

● Vídeo cuantificación de ADN (​https://www.youtube.com/watch?v=GEjGjCtEWcA​)
● Video electroforesis de ADN en geles de agarosa (​https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38​)

● Artículos​ científicos

IV. PARTE PROCEDIMENTAL

1. Condiciones del área de trabajo para la extracción de ácidos nucleicos

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● Se debe trabajar en un área aséptica , para ello, se debe limpiar la mesa de trabajo con lejía al 1% que permite
evitar posible contaminación.
● Se usar la indumentaria adecuada como los equipos de protección personal( guantes, guardapolvo, gafas o
protector facial,zapatos y gorra)
● Se debe tener un área de trabajo ventilada.
● Prender el extractor de gases.
● Tener el área de trabajo limpia sin objetos personales ( mochilas, calculadoras, celulares ).
● Está prohibido comer en el laboratorio asimismo evitar correr.

2. Condiciones de la muestra biológica. Fuentes de ADN para la investigación en el área toxicológica

Fuentes de ADN para la investigación en el área toxicológica:

● Muestras forenses:
○ Pelo: Sin raíz (ADN mitocondrial), con raíz
○ Osteocitos: Muestra de hueso.
○ Epitelio bucal: Hisopado.

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3. Protocolo de extracción de ADN

Se simulará el uso del kit QIAamp DSP DNA Blood Mini que comprende 4 etapas:

● Lisis de las células presentes en la muestra de sangre

● Unión del ADN genómico del lisado celular a la membrana de una columna de centrifugación
QIAamp Mini ​(purificación y precipitación)
● Lavado de la membrana
● Elución del ADN genómico de la membrana
Lisis de las células sanguíneas

Las muestras se lisan en condiciones de desnaturalización a altas temperaturas.

La lisis se realiza en presencia de proteasa QIAGEN (QP) y solución tampón de lisis (AL).

1. Añada a un tubo de lisis (LT) 20 μl de QP ​(proteinasa K)​, 200 μl de muestra ​(sangre fresca)​ y 200 μl de
AL.
2. Agite en vórtex 15 segundos.
3. Incube 10 minutos a 56ºC t​ (para que la proteinasa K se active su haga sus cosas uwu, ejerza su efecto,
el ADN está liberado de la histona)
4. Añada 200 μl de etanol. ​(para que haya precipitación)
5. Agite en vórtex 15 segundos
Con esto se purifica: El óxido de silicio tiene una carga neta positiva, el ADN tiene carga positiva, por
afinidad se une a la matriz. Se va absorber el ADN. En la matriz tendremos el ADN adherido

Unión del ADN genómico a la membrana de la columna de centrifugación QIAamp Mini

Para optimizar la unión del ADN genómico a la membrana de la columna de centrifugación QIAamp Mini se
añade en primer lugar etanol a los lisados.

Cada lisado se dispensa entonces en una columna de centrifugación QIAamp Mini y, a medida que el lisado
la atraviesa por efecto del vacío o de la fuerza centrífuga, el ADN genómico se adsorbe sobre la membrana
de gel de sílice.

6. Transfiera el lisado a la columna de centrifugación QIAamp Mini.

7. Centrifugue 1 minuto a 6.000 x g. Descarte del centrifugado. ​(Aquí elimino trazas de proteínas, lípidos,
etc)
8. Coloque la columna QIAamp Mini en el tubo de lavado, añada 500 μl de AW1, centrifugue 1 minuto a
6.000 x g. Descarte del centrifugado.
9. Coloque la columna QIAamp Mini en el tubo de lavado, añada 500 μl de AW2 y centrifugue 1 minuto a la
máxima velocidad (aproximadamente 20.000 x g o 14.000 rpm).
10. Ponga la columna de centrifugación QIAamp Mini en un tubo de elución. Añada 50–200 μl de AE e
incube durante 1 minuto. Centrifugue 1 minuto a 6.000 x g.

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11. El eluido final contiene la muestra de ADN que deberá analizar mediante espectrofotometría y
electroforesis en geles de agarosa.

4. Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría 

Una vez extraído el ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto, es mediante la
cuantificación. Según el método que se utilice, se puede apreciar la cantidad de ácidos nucleicos totales,
proteínas presentes, pureza del extracto, ADN humano solamente, etc.

Una característica del ADN es la de presentar un pico de absorción en presencia de radiación a 260 nm.
Este pico de absorción se debe a la presencia de las bases púricas y pirimídicas. El ADN bicatenario
presenta una absorción menor que el monocatenario, debido a que el emparejamiento de las bases (por
enlaces de puentes de hidrógeno) reduce la absorción de la luz ultravioleta. Esta particularidad es
aprovechable en la cuantificación de ADN; una buena proporción se encuentra en el rango de 1,7 a 1.9, sin
embargo, así como encontramos ADN en la muestra, también se encuentran contaminantes tales como
proteínas o fenol residual que pueden incurrir en un falso positivo. Es decir, la absorbancia a 260nm no es
específica para ADN.

5. Evaluación de la integridad de la muestra de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa

La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas, esta separación tiene lugar
debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la
influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Debido a su carga
eléctrica negativa, los ácidos nucleicos pueden migrar a través de una matriz cuando un campo eléctrico es
aplicado sobre ella, separándose en base a la diferencia de sus pesos moleculares. La naturaleza del
enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condicionará la carga de un ácido nucleico.

La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas apropiadas, generalmente son horizontales y

requiere de dos elementos indispensables:

La fase móvil​. Es el medio amortiguado (​Buffer)​ que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia
los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. TAE o TBE

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Solución TAE 50X (Solución stock)

Tris 242 g
Ácido acético 57.1 mL
EDTA 0.5 M 100 mL
Ajustar a pH 8
Solución TBE 10X (Solución stock)
Tris 108 g
Ácido bórico 55 g
EDTA 0.5 M 40 mL
Ajustar a pH 8

La  fase  estacionaria  o  soporte​. Es un polímero de naturaleza gelatinosa con un tamaño de poro
homogéneo que se haya sumergido y embebido en la fase móvil, por lo general se utiliza agarosa, un
polímero lineal, extraído de un alga marina.

Los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido hasta que se consigue una solución
transparente y límpida. Posteriormente la solución se coloca en un molde y se deja solidificar. Una vez que
esto sucede, la agarosa forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración misma de
la agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN, cargado negativamente a pH
neutro, migra hacia el ánodo. No obstante, existen una serie de factores que afectan o modifican la tasa de
migración del ADN en geles de agarosa:

1. Tamaño de la molécula de ADN​: ​Las moléculas lineales de ADN doble cadena, migran a través de
la matriz del gel a tasas que son inversamente proporcionales al log10 del número de pares de bases
que contienen. Las moléculas más grandes migran mucho más lentamente debido a que sufren una
gran fricción y resistencia en el avance ya que se arrastran a través de los poros del gel durante la
corrida menos eficientemente que las moléculas pequeñas.

2. Concentración de la Agarosa: ​Un fragmento lineal de ADN de un tamaño dado migra a diferentes
tasas a través de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa.

En la Tabla 1 se presenta la relación entre la concentración de agarosa y la resolución de los

fragmentos de ADN que se puede visualizar.

Tabla 1: ​Rango de separación en geles conteniendo diferentes concentraciones de agarosa.

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Porcentaje de agarosa en gel  Resolución del tamaño de ADN en kb

(p/v)
0.3 5-60
0.6 1 a 20
0.7 0.8 a 10
0.9 0.5 a 7
1.2 0.4 a 6
1.5 0.2 a 3
2.0 0.1 a 2

3. Voltaje aplicado: ​A bajo voltaje, la tasa de migración de fragmentos lineales de ADN es proporcional al
voltaje aplicado.

4. Composición del Buffer de corrida: ​La movilidad electroforética del ADN es afectada por la
composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (p.e. si se omitiera el buffer
de corrida por error) la conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra, si lo hace, muy lentamente. En
buffers con elevada fuerza iónica (p.e. si por error se utiliza el buffer de corrida al 10X) la conductividad
eléctrica es muy eficiente generándose calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se
desnaturaliza. El buffer más utilizado generalmente es TAE aunque su capacidad de buffer es un tanto baja
y en electroforesis prolongadas tiende a agotarse durante la corrida (el ánodo se vuelve alcalino y el cátodo
ácido). El TBE, aunque un poco más caro, posee una capacidad de buffer significativamente mayor. El
buffer comúnmente utilizado para electroforesis de ADN de simple cadena desnaturalizado es el TAE 1X.

Visualización del ADN en gel de agarosa​. La tinción con bromuro de etidio, es el método más empleado de

visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y es considerado como el agente que se intercala entre
las bases nitrogenadas presentando fluorescencia cuando se incide radiación ultravioleta.

Procedimiento para la electroforesis de muestras de ADN em geles de agarosa

1. Preparar el gel de agarosa al 1%, pesar agarosa suficiente para 30 ml de buffer TAE 1X.
2. Fundir la agarosa en un horno microondas.
3. Dejar enfriar por 6 minutos agitando suavemente con movimientos circulares.
4. Colocar la agarosa en el molde para electroforesis horizontal con un peine de 8 pozos.
5. Una vez que gelifique retirar el peine y colocar el molde en la cámara de electroforesis horizontal y agregar
buffer TAE 1X hasta cubrir el gel.

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6. Colocar 4 µL del ADN muestra y 1 µL del buffer de carga (Loading de carga 6X 0.25% azul de bromofenol
0.25% xylen cyanol FF 30% de glicerol en agua)
7. Correr el gel a 80 V constante del polo negativo al polo positivo por 30 minutos.
8. Luego de este tiempo teñir el gel con una solución de bromuro de etidio.
9. Visualizar el gel en un transiluminador.
10. Fotodocumentar y describir lo que se observa.

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RESULTADOS PARA EL INFORME

Desea realizar una prueba de PCR para determinar un polimorfismo asociado a la respuesta a un
determinado tóxico en 4 pacientes, para lo cual extrae sangre utilizando el kit comercial utilizado en la
práctica.
Muestra de partida 200 uL.
El ADN de cada paciente fue eluido con 25 ul del tampón correspondiente. Ha diluido 2.5 µL del ADN
purificado en un volumen de 1000 µL de agua destilada libre de nucleasas. A continuación ha medido la
absorbancia de la muestra diluida a 260 y 280 ŋM y ha obtenido las siguientes lecturas. Considere que una
solución de ADN a una concentración de 50 ug/mL tiene una absorbancia a 260 ŋM igual a 1.0.
1 2 3 4
Abs 260 nM 0.435 0.637 0.545 0.767
Abs 280 nM 0.195 0.458 0.289 0.536
Concentración de ADN en
ug/ul
Ratio 2.23  1.39  1.88  1.43 
Rendimiento en ug
Rendimiento en ug de
ADN/mL de sangre

Para la electroforesis en geles de agarosa tomó 4 ul de cada muestra que mezcló con 1 ul del tampón de
carga (

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