UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE INGENIERÍA AGRÓNOMA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA VEGETAL

Determinación de ADN y Electroforesis en muestras Vegetales

DOCENTE:

HIDALGO RODRIGUEZ, ERNESTO JOSE

ESTUDIANTES:

Asunción Ramírez Joseph

Castillo Salazar Sebastian
Oyarce Baltodano Brenda
Ponce de León Vicente Nery
Ramos Urbina Hellen
Robles Paredes Sandra
Zea Lombardi Balloreth

TRUJILLO - 2022

INTRODUCCIÓN:

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OBJETIVO

 Extraen DNA de muestras vegetales

MATERIALES Y EQUIPOS:

(Para extracción de ADN)

1. Materiales
 Fresa
 Papel filtro
 Gasa
 Bolsa Ziploc
 Champú o detergente transparente
 Mortero y pilón
 Microtubos de centrífuga
 Gotero
 Beakers
 Sal de mesa
2. Equipos
 Ultracentrífuga
 Nanofotómetro

(Para lectura de las muestras con Eletroforesis

1. Materiales
 Búfer TAE 50x
 Agarosa
 GelRed
 Marcadore de peso
 Microtubos de centrífuga
 Puntas de plástico
 Parafilm
 Dye para ADN

2. Equipos
 Ultracentrífuga
 Nanofotómetro
 Cámara de electroforesis horizontal
 Fotodocumentador

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MÉTODO:

1. Extracción de ADN con Protocolo Casero Preparación de Búfer de Extracción

Preparar 100 mL de buffer de lisis casero (para 100 mL, mezclar 10 ml de shampoo, ¼ de
cucharada de sal común y 90 mL de agua).

Preparación de Extracto de Frutas

Colocar una fresa dentro de la bolsa Ziploc.
Moler a mano hasta obtener una mezcla homogénea.

Dilución de Membranas y Filtrado

Agregar 10 ml del búfer de extracción a la bolsa.
Cerrar y continuar triturando por 2 minutos más.
Filtrar en gasa en un vaso de precipitación pequeño.

Precipitación en Alcohol Etílico

Colocar etanol en la congeladora por 10 minutos.
Agregar el etanol por la pared del vaso lentamente.
Esperar 10 minutos para la separación por fases de las fibras de ADN.
Extraer con varilla de vidrio en un microtubo, centrifugar por 1 minuto a 12000rpm.
Eliminar el excedente de etanol y colocar con 1ml de etanol para realizar el lavado.
Centrifugar por 1 minuto a 12000rpm y eliminar el excedente de etanol.

Dilución en Agua
Diluir con 1000ul de agua destilada diluir el pellet con la punta de la micropipeta.
Agitar con vórtex y colocar en agitador térmico a 60°C por 10 minutos.

Conservación de ADN
Rotular y conservar en congelación a -20°C para electroforesis
posterior.

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2. Preparación de Muestras para Corrido Electroforético

Preparar parafilm con la misma rotulación de las muestras que se van a analizar. Agregar
1 parafilm para marcador de peso molecular.
El volumen final en cada vial será de 10ul, en que se colocan muestra, agua y dye. Se
recomienda:
- 2ul de dye.
- 3ul de muestra (la proporción de la muestra puede variar, dependiendo de la
concentración de ADN en cada muestra y la muestra se reemplaza por Ladder 1Kb para
los viales con marcador de peso molecular).
- 5ul de agua grado molecular (la proporción de agua puede variar, dependiendo de la
cantidad de muestra que se agregó).
Agitar las muestras con vórtex y centrifugar 1 minuto a 12000 rpm para asegurar que toda
la muestra vaya al fondo del vial.
Mantener los viales en hielo, mientras se prepara el sistema de electroforesis.

Preparación del buffer de corrido (1x)

Preparar una cantidad suficiente de Buffer TAE 1x, para cubrir el gel, sin exceder la
capacidad máxima de la cámara.
Utilizar el búfer TAE (50x) (contiene Tris, ácido acético y EDTA), el cual se lleva a una
concentración de 1x.
Diluir con agua destilada dependiendo de la cantidad de buffer que se va a preparar. Por
ejemplo: para 1000ml de TAE 1x, agregar 20ml de TAE 50x y aforar a 1000ml con agua
destilada.

Preparación del Gel de Agarosa (1% agarosa en buffer TE o TAE)

Pesar agarosa para obtener concentración de 1%. Por ejemplo: para el gel de 70ml, se
pesará 0.7g de agarosa.
Diluir la agarosa con el buffer TAE 1x en un matraz exclusivo para preparación de geles
de agarosa.
Disolver moviendo constantemente en el microondas o cocina hasta ebullir por 1 min
(hasta que la solución sea cristalina) y esperar un momento, agitando constantemente
hasta llegar a 80°C.
Agregar 0.7 ul de GelRed (1ul de GelRed por cada 100ml de gel).
Verter en la cubeta preparada en un lugar nivelado y colocar el peine.
Cubrir el gel con papel aluminio. Dejar enfriar y gelificar hasta el punto de opacidad.
Retirar el peine y los bordes de goma para dejar el gel listo.

Montaje de la Cámara de Electroforesis

Colocar el gel con su soporte dentro de la cámara.
Cubrir lentamente con el buffer de corrido. Asegurar la cobertura total del gel.
Los pocillos van dirigidos hacia el polo negativo, desde donde migrarán al polo positivo.
Cargar las muestras previamente preparadas en cada pocillo, sin perforar el gel con la
micropipeta ni perder muestra.
Colocar la tapa y conectar los cables a la cámara y luego a la fuente de poder.
Corrido electroforético
Verificar la disposición de los pocillos hacia el polo negativo (ácidos nucleicos corren de
negativo a positivo) y de los cables.
Correr a 100V por 30 minutos.

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 Verificar el corrido de la muestra en la dirección correcta, según la separación de los
colorantes del dye.

Visualización de ADN en bandas

Al finalizar el tiempo de corrido, el gel se lleva al fotodocumentador.
Se evalúa a 100% de rayos UV.
Se captura la imagen en positivo, negativo y en 3D.

Interpretación de bandas
Se espera aparición de 1 banda correspondientes al ADN genómico.
Explicar la presencia de barridos, más de una banda, o ausencia de la misma.

RESULTADOS:

 Podemos apreciar que los primeros dos resultados son de las muestras de guía
lo que nos indica que ninguna muestra tomada por los grupos pudo extraer
ADN

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DISCUSIÓN:

 Podemos apreciar en los reultados obtenidos de esta experimentación que en

ninguno de los grupos se pudo lograr extraer el ADN de la fresa, esto se pudo
deber a un error en elgun procedimiento tanto de la extracion como de la
letiura, o también gracias a la contaminación de las muestras de tal manera que
no se pueden hacer mas discusiones de los resultados .
CONCLUSIONES:
 A la única conclusion que se puede llegar en este informe es que la próxima
vez que se trabaje para determinr ADN en muestras vegetales se debe ser mas
uidadosos, ya que hemos podido apreciar lo delicado que es trabajar con el
ADN ya que al minimo error no obtendremos resultados.
 Además también podemos oncluir que hacer esta determinación con un
método casero es muy poco confiable

BIBLIOGRAFIA:

 Betancurt-Olvera, M. (2020, 21 de septiembre). COMPARACIÓN DE SEIS

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN EN TEJOCOTE (Crataegus mexicana
Moc. & Sessé).
https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-
73802018000100075
 Gómez J.E. Biología Molecular: principios y aplicaciones. Colombia: corporación
para Investigaciones Biológicas. 2011.749p.

 Rocha Salavarrieta, P. J. (s.f.). Vista de Teoría y práctica para la extracción y

purificación del ADN de palma de aceite. Fedepalma.
https://publicaciones.fedepalma.org/index.php/palmas/article/view/921/921

 Ulloa Sotomayor, A. C. (2020, mayo). Extracción de ADN de Solanum

pimpinellifolium para futuros estudios genéticos. Repositorio Digital USFQ: Página
de inicio.
https://repositorio.usfq.edu.ec/bitstream/23000/8724/1/146066.pdf

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