EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO Y EVALUACIÓN DE LA CANTIDAD Y CALIDAD

DEL ADN

ASPRILLA I., Leidy; RENTERIA T., Alejandra; RIASCOS O., Kelly; VANEGAS R., Laura.
Universidad Santiago de Cali. Facultad de Ciencias Básicas, programa Microbiología. Abril 22 de
2022

PALABRAS CLAVE: ADN, lisis celular, solubilidad, RCP, agarosa, electroforesis,

espectrofotometría, proteínas, ácidos nucleicos, proteinasa k, puro.

RESUMEN: Las siguientes prácticas de laboratorio tuvieron como objetivo reconocer las bases
bioquímicas y moleculares de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos, además cuantificar y
determinar la pureza del ADN extraído mediante espectrofotometría y electroforesis, para el
desarrollo de diversas técnicas.

INTRODUCCIÓN: El ADN se encuentra en el interior del núcleo, disperso, muy replegado y unido
a proteínas formando la cromatina. Para poder extraerlo es necesario romper las células y separar al
núcleo para después romperlo y liberar el ADN, es útil para la realización de diversos estudios
diagnósticos utilizando pruebas de biología molecular, para poder realizar dichas pruebas es
necesario iniciar con extraccion y purificacion y así obtenerlo de diferentes fuentes con un alto grado
de calidad y pureza de esta forma los resultados serán más exactos y confiables. Existe una gran
variedad de métodos por lo que debe elegirse el adecuado, los comúnmente empleados combinan
procesos químicos, físicos y mecánicos e incluyen tres pasos que son: Extracción, la cual implica
sacar un adn del comportamiento celular por medio de una lisis. Purificación, esta permite separar el
ADN de los demás componentes celulares y por último una precipitación en la cual ya tendríamos el
ADN completamente puro. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí
formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos
ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la
molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable
la estructura helicoidal. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores
potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales,
desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una
vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren
preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos
pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas
principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación
y redisolución del ADN.

MATERIALES: Vortex
Tubos microcentrífuga de 1,5 mL
Materiales: Microcentrífuga
(1) Beaker 50 mL de vidrio o plástico Micropipetas de 1000 ul con puntas
Varilla de agitación Micropipetas de 100 ul con puntas
Pipetas graduadas de 5 mL Toallas de papel
Propipetas
(A) Balanza
Beaker 100 ml Reactivos:
Vidrio reloj (1) Detergente líquido o SDS (10%)
Microespatula Etanol 96% (frío)
Probeta de 50 ml Etanol al 70%
Microondas Buffer TE (Tris HCl 10mM pH 8,0;EDTA 1
Cámara de electroforesis horizontal mM, pH 8,0)
Fuente de poder
Cinta de enmascarar (A) TBE 1X
Pipeta 0,5-10 ul con puntas Agarosa
Transiluminador UV Buffer de carga
Sybr Green
(B) Espectrofotómetro UV-VIS Marcador de peso molecular
Celdas de cuarzo Muestra de ADN
Micropipeta de 0.5-10 ul con puntas
Micropipeta de 100-1000 ul con puntas (B) Agua MiliQ o agua desionizada
Calculadora Muestra de

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Se realizaron 10 extracciones de ADN genómico a partir de las

células epiteliales de la mucosa bucal de cada estudiante, empleando los siguientes métodos:
Extracción de ADN, Lisis celular, Precipitación, Deshidratación, Rehidratación, Electroforesis y
Espectrofotometría.

Concentración Absorción Absorción Relación

(ng/ul) A260 nm A280 nm A260/A280

Blanco (calibración) 0 0 0,0

Muestra 1 205,1 41,03 22,44 1,8

Muestra 2 46,3 8,06 4,3 1,9

Muestra 3 11,3 4,77 1,45 3,3

Muestra 4 64,7 9,33 4,88 1,9

Muestra 5 61,8 13,63 7,32 1,9

Muestra 6 139 52,1 48,5 1,1

Muestra 7 77,2 1,54 1,34 1,1

 Muestra 8 73,6 1,47 1,51 1,0

Muestra 9 118,2 0,48 0,5 1,0

Muestra Problema 50 4,03 2,18 1,8

Tabla 1, La pureza del DNA se calculó mediante la relación entre la absorbancia A260 nm y A280
nm, considerando como x < 1.8 --> ADN CONTAMINADO CON PROTEÍNAS O FENOL, 1.8 ≤ x ≤
2.0 --> ADN PURO, 2.0 > x --> ADN CONTAMINADO CON ARN.

De acuerdo a los valores arrojados por la tabla 1, llegamos a la conclusión que la mitad de las
muestras son puras y el resto se encuentran contaminadas, específicamente el 10% infectadas con
ARN y el 40% con carbohidratos y fenoles, ya que se encuentran fuera de los indicadores establecidos
de tolerancia. Otros factores a tener en cuenta Según Hills, "planteó que la utilidad o ventaja de un
protocolo de extracción de ADN con respecto a otros está directamente relacionada con el método de
preservación del material inicial (fresco, seco o congelado), lo cual tiene una gran incidencia a la hora
de obtener un ADN de alta pureza y cantidad, suficiente para el desarrollo de marcadores moleculares
basados en PCR. De manera similar, el estado sanitario, fisiológico y químico de las muestras, inciden
en la pureza y cantidad del ADN".

CANTIDAD DE ADN: La concentración de ADN se determinó por espectrofotometría A260 nm en

una solución diluida de ADN 1/100. Y el cálculo se obtuvo de la siguiente fórmula:
( A 260 nm x 1000 ) x 50 ug/ml = ug/ml.

CALIDAD DE ADN: Se evaluó mediante la separación de ADN en electroforesis en gel de agarosa,

migrado a 110 voltios durante 30 minutos, utilizando el marcador de pares de bases para determinar
la longitud de las muestras, en la absorbancia 260/280.

PREGUNTAS:

1. ¿Qué indica el cociente (260/280) para cada una de las muestras y a qué se debe que se haya
obtenido estos valores? Menciona algunas recomendaciones, en caso de ser necesario para
mejorar las muestras que resultaron contaminadas.

R// A260/A280 = Relación de pureza de una muestra. La obtención de cada valor se debe al contenido
de la muestra, ya que está puede contener ADN junto a proteínas, nucleótidos, aminoácidos, ARN,
entre otros. Y al encontrarse en la dilución se consideran contaminantes que arrojaran resultados que
difieren de los esperados o fuera de los rangos aceptados.

Las recomendaciones más apropiadas son tener una buena esterilidad a la hora de llevar a cabo el
procedimiento. Por otro lado si el producto se encuentra contaminado se pueden emplear distintas
técnicas para purificar la muestra, sin embargo este proceso es demasiado complicado en ocasiones es
más fácil volver a realizarlo desde la extracción.
2. ¿Por qué un fragmento de ADN de 10 Kb no migra más rápido que un fragmento de 0,5 Kb,
cuando se someten a un campo eléctrico en la electroforesis en geles de agarosa, si el primero
posee mayor número de grupos fosfatos?

R// Puesto que la movilidad de la molécula de ADN está influenciada por su tamaño, lo que es
directamente proporcional al número de pares de bases que lo conforman. En cuanto al gel de agarosa
asegura un transporte más rápido en moléculas pequeñas, debido a que estás pueden atravesar los
poros que van desde 50 pb hasta 40 kb con mayor facilidad.

3. ¿Cuál es la relación entre las medidas obtenidas a 260nm y 280nm con la pureza de una
muestra de ADN?

R// La relación entre las medidas obtenidas se consideran un ADN: 1.8 ≤ x ≤ 2.0 de pureza óptima, x
< 1.8 contaminado con compuestos aromáticos, x > 2.0 contaminado con ARN.

4. La siguiente imagen indica los resultados de una electroforesis en gel agarosa de extracciones
de ADN de células bucales.

• Determine el peso aproximado de la banda coloreada para todas las muestras:

R// Miden 550 pb

• ¿Por qué todas las muestras tienen el mismo patrón de banda?

R// Porque todas tienen la misma longitud, al no realizar la PCR no sé logró fragmentar el ADN y
dejó a las muestras con un mismo peso.

CONCLUSIÓN: En esta práctica aprendimos cómo extraer el ADN ya que por medio de este
podemos determinar las características de diferentes patologías, también se han diseñado diversos
métodos de extracción como lo es el método de DNA-UMSAgen, simplifica los pasos, ahorra tiempo
y dinero, obteniendo DNA de alta calidad tal como lo demuestran los estudios de espectrofotometría y
de electroforesis de gel de agarosa, la valoración de la concentración del ARN fue realizada por
espectrofotometría A260 y A280 nm, se tuvo en cuenta el grado de pureza obtenido de la relación de
absorbancias A260 / A280 considerándose una relación de x > 1,8 - 2,0 como un indicativo de grado
de pureza y por lo tanto estaba entre un rango de calidad pura, lo cual es muy Importante en esta
práctica ya que dependiendo el resultado se obtiene una buena calidad en este trabajo mostramos que
es posible diseñar e implementar una intervención didáctica de aprendizaje por investigación dirigida
y orientada a la extracción del ADN con material cotidiano lo cual es una muestra de futuros
profesionales lo que demuestra que la intervención favorece significativamente el aprendizaje .

MÉTODOS:
REFERENCIAS CITADAS:
Extracción y purificación de ADN, 2014.
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

Hills DM, Mortiz C. Molecular Systematics. Sinauer. Associates, INC Publishers. Sunderland,
Massachu-setts. USA. 1990; 238 p.
https://www.redalyc.org/pdf/499/49912232003.pdf