MÉTODOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

¿QUÉ ES UNA MUESTRA?

Es la parte del espécimen que se utiliza para la caracterización o análisis.

ESPÉCIMEN:
es un material, líquido, sólido o gaseoso que se caracteriza o analiza en un laboratorio.
-Sangre
-Orina
-Heces
-Esputo
-LCR (liquido cefaloraquideo)

¿QUÉ ES UNA MUESTRA EN BIOLOGÍA MOLECULAR?

Es la extracción de DNA, RNA o Proteínas de una parte del espécimen que se utiliza para la caracterización
molecular.

MANEJO DE MUESTRAS EN BM
La implementación y realización de las técnicas moleculares debe llevarse a acabo por personal capacitado.
El manejo de la muestra implica tres pasos fundamentales:

1. Selección de la muestra
2. Toma de muestra Higiene en todo el proceso
3. Preservación de la muestra

La muestra de elección dependerá del tejido donde se expresa el material de interés:

Ej., si se quiere determinar los niveles de expresión del gen de la telomerasa en cáncer de pulmón, la
muestra indicada será la biopsia del tumor.
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

TIPOS DE ADN
-ADN nuclear -ADN mitocondrial -ADN cloroplástico en plantas

-ADN plasmídico -ADN viral

OBJETIVO DE UNA BUENA EXTRACCIÓN

Cantidad
Calidad (integridad)
Pureza (ausencia de contaminaciones)

ELECCIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN

Se realiza en función de los siguientes criterios:
-Tipo de ácido nucleico que se va a extraer:
ADN de cadena sencilla (ADNss), ADN ds, ARN total, ARNm o ARN ribosomal.
-Organismo origen del ácido nucleico:
mamíferos, plantas, procariontes o virus.
-Fuente del ácido nucleico:
cultivo celular, tejido, sangre, expectoración, suero, orina etc.
-Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído.
De ese modo, determinar el rendimiento, pureza y tiempo de extracción.

ETAPAS BÁSICAS DE UN PROCEDIMIENTO GENERAL ARA EXTRACCIÓN Y

PURIFICACIÓN DE AN (ACIDOS NUCLEICOS)

Disgregación o fragmentación del tejido

Estas etapas Durante todo el

deben ir Lisis celular procedimiento se
acompañadas debe usar
de medidas o
agentes que soluciones y
clarificación material estéril, además
inactiven
nucleasas de guantes
celulares
purificación

Cualitativo: análisis Cuantitativo:

electroforesis espectrofotometría UV
1. MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS CELULAR PARA LA EXTRACCIÓN DE AN

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio
(células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).

MÉTODOS FÍSICOS MÉTODOS QUÍMICOS

-Homogenización mecánica -Detergentes
-Molienda manual en mortero
-Bolitas de vidrio
-Sonicación

MÉTODOS ENZIMÁTICOS
-Lysozima: rompe enlaces b-1.4- entre N-acetil murámico y N- acetil glucosamina de peptidoglicán
de la pared celular de bacterias
-Lyticasa: rompe enlaces b-1.3 de glucano de levaduras
-Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y membrana plasmática e interacciones
célula-célula.

COMPONENTES DE UNA SOLUCIÓN DE LISIS

•Etilen diamino tetracetico (EDTA).
-Quelante de iones Mg2+, baja la concentación efectiva de este ión.
-Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza la degradacion de AN durante la extración/purificación.

• Amortiguador de pH (7-8).

2. CLARIFICACIÓN. ELIMINACIÓN DE RESTOS CELULARES (DEBRIS)

-Centrifugación
-Filtración
-Método mixto: centrifugación + filtración

3. PURIFICACION
-Desproteinización con fenol, que al denaturar proteínas causa su precipitación.
-Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)
-Extracción de DNA desde un gel de agarosa

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO

1. Cell Lysis
2. Centrifuge to remove cell debris
3. Phenol: choroform extraction
4. Ethanol precipitation
EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DEL TIMO

Tejido de timo-> Adición de amortiguador de pH, con EDTA -> Adición de detergente -> Molienda-
lisis -> Tomar alícuota -> Adición de una sal (NaCl) (salting out) -> Centrifugación -> an en
solucion
Acuosa y proteina insoluble (se separan) -> Adición de etanol -> DNA es insoluble en solución
alcohólica -> centrifugacion -> sobrenadante
l-> Sedimento -> Lavados y resuspención en H2O ultrapura

ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE AN Y CRITERIOS DE PUREZA

ANALYZING DNA SAMPLES

Analysis of samples:
Barley (A): This sample is fine
Corn (B):This sample is fine
Oat (C) :This sample is fine
Rice (D): This sample is fine
Wheat (E): This sample has severe degradation can work for PCR but should re-extract

ESTUDIO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ENDÓGENOS

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA GENÓMICA (ADN)

Se puede tomar cualquier célula nucleada. Pero se elige la muestra que involucre el procedimiento
menos invasivo. Ej. sangre periférica con anticoagulante: GB.

APLICACIONES:
-Identificar individuos.
-Detectar polimorfismos génicos de predisposición o protección.
-Analizar mutaciones.
-Establecer el diagnóstico de enfermedades génicas.

ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE U INDIVIDUO

estudiar los cambios bioquímicos que experimenta el organismo en respuesta a una situación en
particular
REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
Manera espacial y temporal

ESPACIAL
• Representa la base de la diferenciación celular
• Los genes no se expresan en todos los tejidos. Ej., la insulina se expresa en las células beta del
páncreas; la albumina en los hepatocitos, etc.

TEMPORAL
• Depende del estado metabólico en que se encuentre el individuo: sano/enfermo; triste/eufórico
• El individuo, es el resultado de la expresión de sus genes en un momento dado.

DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS EXÓGENOS

Detección del ADN procedente de cualquier fuente ajena al paciente, como bacterias y virus de
ADN. Por lo que constituye una herramienta útil para el diagnóstico molecular de enfermedades
causadas por microorganismos.
Ej. Detección de Mycobacterium tuberculosis en 24 h a diferencia con cultivo microbiológico 5
días.

Para la detección de genomas exógenos (ADN/ARN), la muestra dependerá de la historia natural del
microorganismo infectante.
Ej. En la detección del VHB, VHC y HIV, que los virus se diseminan por todo el organismo
(SUERO).

TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL ÁREA MÉDICA

ADN
PCR
reacción en
SOUTHERN BLOT SECUENCIACIÓN cadena de la
polimerasa
+
TEGNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE

Creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran

juntas de manera natural.
Moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes
biológicas.

CLONACION
Mediante la clonacion de DNA se logra:
Conseguir que un fragmento de DNA se integre en un elemento genético autoreplicable (plásmido)
en una bacteria, de tal manera que la molécula puede ser reproducida generando miles de copias
idénticas.

EN UN EXPERIMENTO DE CLONACIÓN SE REQUIERE:

Vector apropiado
Molécula de DNA de replicación autónoma que se propaga correctamente en una determinada célula
manteniéndose en cierto número de copias

Fuente de DNA
Cromosómico, CDNA, DNA Recombinante

ENZIMAS PARA LLEYAR A CABO LA CONSTRUCCIÓN

DEFINICIONES
• Enzima de restricción: enzima capaz de cortar el DNA en un lugar determinado, denominado diana
o sitio de restricción.
•Diana o Sitio de restricción: secuencia de DNA, que es reconocida por una enzima de restricción.
•Vector de clonación: molécula de DNA artificial capaz replicarse en un organismo hospedador (p.e.
en una bacteria).
•DNA recombinante: molécula de DNA creada artificialmente a partir de fragmentos con orígenes
distintos.
•Clon: Copias idénticas de la molécula de DNA recombinante.

TIPOS DE VECTORES
-Clonación
Almacenamiento, mantenimiento, propagación de un fragmento de DNA.

-Expresión
Contiene elementos genéticos para dirigir la expresión de un gen en un tipo de célula específico,
produciendo muchas copias de una proteína seleccionada, en una célula huésped.
PLASMIDOS
información genética contenida en moléculas de DNA
distintas a las del cromosoma bacteriano

ADN Circular De doble cadena Unidad de

replicación independiente Múltiples copias

-Propiedades fenotípicas

-Adaptación a ciertos ambientes

ADN PLASMIDICO
-Islas de patogenicidad

Bacterias potencialmente patógenas para el hombre (Genes para la sintesis de sustancias tóxicas)
Clostridium tetani

Genes que codifican para enzimas capaces de degradar algunos antibióticos

B-lactamasa – resistencia a los b-lactámicos: Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus o
Haemophylus influenzae

WHAT ARE RESTRICTION ENZYMES?

-Molecular scissors that cut double stranded DNA molecules at specific points.
-Found naturally in a wide variety of prokaryotes
-Evolved by bacteria to protect against viral DNA infection
-An important tool for manipulating DNA.
-Over 3,000 know enzymes

DISCOVERY
-Arbor y Dussoix en 1962 descubrieron que ciertas bacterias contienen endonucleasas que tienen la
capacidad de escindir el ADN.
-En 1970, Smith y sus colegas purificaron y caracterizaron el sitio de escisión de una enzima de
restricción.
-Werner Arbor, Hamilton Smith y Daniel Nathans compartieron el Premio Nobel de Medicina y
Fisiología de 1978 por su descubrimiento de las enzimas de restricción.

Existen 3 tipos de enzimas de restricción

Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la
secuencia de reconocimiento, las Tipo I
cortan lejos de la secuencia de
reconocimiento, ya sea río arriba o río
abajo. Las Tipo III cortan de 8- 12 bases
antes o después de la secuencia que
reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través
de la molécula de DNA, desde el lugar
de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y
predecible dentro de la secuencia que
reconocen. c. Sólo requieren Mg++ como
cofactor.
d. No necesitan ATP.

ENZIMAS DE RESTRICCION

Exonucleasas
Último nucleótido del extremo 5' o 3' de un polinucleótido

Pueden llegar a degradar completamente un ácido nucleico lineal

ENDONUCLEASAS
Enlaces fosfodiéster situados en el interior de los polinucleótidos.

Estas enzimas no requieren un extremo libre, por lo que pueden

cortar ácidos nucleicos circulares.

• Se
unen al
DNA,

reconocen y cortan una secuencia-específica (Secuencia de Reconocimiento o Sitio de corte)

• Actúan como mecanismo de defensa
• Normalmente reconocen secuencias palíndromas

NOMENCLATURA
• La primera letra del nombre de la enzima proviene del
género.
• Las próximas letras de la especie.
• La cuarta letra de la cepa.
• EL número romano hace referencia a la cantidad de
endonucleasas que han sido extraídas de la misma
bacteria.
ISOESQUIZÓMEROS

Los isoesquizómeros son dos enzimas de restricción con la misma secuencia de reconocimiento,
aunque pueden que no corten en la misma posición.

Tipos de corte
-Puentes de hidrogeno ADN
-Recombinante

Quedan extremos de simple cadena complementarios entre sí Extremos cohesivos o pegajosos

Corte en el centro del eje de simetría Extremos romos o rasurados

The DNA
Digestion Reaction
Restriction Buffer provides optimal conditions
• NaCI provides the correct ionic strength
• Tris-HCI provides the proper pH
• Mg2+ is an enzyme co-factor
Incubate at 37 c
Patron de restriccion por electroforesis

Electroforesis de DNA

-Tecnica usada para separar y purificar macromoleculas (i. e. proteinas, acidos nucleicos) que varian
en tamaño, carga o conformacion.

-Cuando moleculas cargadas son colocadas en un campo electrico, estas migran hacia el polo
positivo (anodo) o polo negativo (catodo) de acuerdo a su
carga.

Tipos de geles

-Agarosa: polisacárido extraido de algas. No tóxico. Poco

poder de resolución pero alto grado de separación. Separa
fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.
-Poliacrilamida: polímero de acrilamida.Tóxico. Menor
grado de separación pero alto poder de resolución. Usado
para fragmentos de DNA de 500 pb. Usado para separar
mezclas de proteínas.

Geles de agarosa

Electroforesis horizontal
Preparar el gel.
2. Aplicación de la muestra.
3. Electroforesis.
4. Detección por tinción con
Bromuro de Etidio (BrEt): se intercala en el DNA y
al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia.

Preparación de gel de agarosa

-Proceder a cargar las muestras
-Correr el gel
-Teñir (Azul de coomassie)

Agarose electrophoresis loading

-Separating Restriction Fragments, I (Separando

fragmentos de restricción, I)
La corriente eléctrica transporta el ADN cargado
negativamente a través del gel hacia el positivo (electrodo rojo).

-Separating Restriction Fragments, II

Tamices de gel de agarosa
Fragmentos de ADN según su tamaño.
Pequeños fragmentos moverse más lejos que grandes fragmentos

DIGESTIÓN DOBLE DE KDEL

 NcoI -> 1
Bst EII -> 1548 y 2298

Ncol/BstEll 2067pb
1548pb
750pb

Ejercicio

Dada la secuencia de ADN siguiente:

...ATGCGAATTCCCGCCAGGTTATGCAATTCATG... ...TACGCTTAAGGGCGCTCCAATACGT
TAAGTAC...

Cuales y cuantos serían los fragmentos que originaría si se corta con la restrictasa EcoRI
Dado el siguiente fragmento de ARNm:

... U U A C G U U A A G C U A U A G ...

Cual sería el DNA formado por retrotranscripción

Sería cortado por la restrictasa EcoRI?
EJERCICIO

EJERCICIO 2
RESPUESTAS

APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

1. Hacer mapa de restricción de un plásmido.

El ADN se corta con una o varias enzimas de restricción simultáneamente, para determinar el
número de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre
ellos.

2. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN
recombinante.

Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo de enzima, cortar el
fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas de ADN,
generando así una molécula de ADN recombinante. Este vector recombinante puede usarse para
transformar células que expresen el gen de interés clonado o puede usarse simplemente para tener
clonado ese fragmento de ADN de interés.

DNA FINGERPRINTING
Análisis de patrones de fragmentos de DNA formados por las endonucleasas de restricción.

IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES

-La existencia de una mutación en un lugar de restricción

impedirá que la enzima corte por ese punto, de modo que
puede detectarse dicha mutación.
-En esta figura se detecta una mutación que define un
nuevo genotipo.
-La banda que se obtiene en este caso es más larga y por
tanto más pesada, lo que se detecta al realizar la
electroforesis.

Enzimas de restriccion

los homocigotos para la mutación tendrán una sola banda más pesada, los homocigotos sin
mutación tendrán las 2 bandas (intermedia y
ligera) y los heterocigotos tendrán las
3 bandas.

Southern blot Aplicaciones

Sirve para la detección de genes específicos en
el DNA celular o secuencias específicas de
DNA. Esta técnica se ha empleado para el diagnóstico y caracterización de diversas
inmunodeficiencias, entre ellas son:
-Distrofia muscular de Duchenne.
-Hipoplasia adrenal congénita.
-Deficiencia de glicerol-quinasa.
-Distrofia miotónica severa.
-Análisis de mutaciones de genes en células B de leucemia linfoblástica crónica, entre otras
enfermedades.

¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA in vitro.

Historia del PCR

• 1985=se crea la técnica molecular conocida como “PCR”
• KaryB.Mullis, Coorporacion CETUS
-Premio Nobel en Química 1993

Procedimiento del “PCR”

• Desnaturalización
• Hibridización
• Extensión

Componentes esenciales en el proceso de PCR

• DNA polimerasa termoestable
• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)
• Cationes divalentes
• Buffer (para mantener el pH)
• DNA molde (Templado)

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA: FRACCIONAMIENTO CELULAR

CC

FRACCIONAMIENTO CELULAR
Conjunto de métodos y técnicas que permiten obtener fracciones puras o enriquecidas de un
componente celular determinado:
a) Organelos (núcleo, mitocondrias, peroxisomas, etc).
b) Fracciones de membrana.
 c) Complejo multiproteicos (citoesqueleto, actina, microtubulos, poros nucleares, etc).

FASES PARA EL FRACCIONAMIENTO CELULAR

1. Homogenización: ruptura de células y tejidos para obtener un lisado celular o tisular en el que la
fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
2. Separación de la fracción celular deseada del resto de los componentes celulares o tejido.

HOMOGENIZACIÓN
-Métodos que permiten la disgregación de tejidos y el rompimiento de las células.
-Produce la ruptura suave de membranas celulares con lo que se libera el contenido celular.
-Desde el homogenizado o extracto crudo, se podrán extraer organelos y/o moléculas de interés
biológico.

MÉTODOS DE HOMOGENIZACIÓN

Homogenización A 4 ́C (en hielo) Tratamiento en Buffer de Lisis

HOMOGENIZACIÓN

DESTRUCCIÓN MECÁNICA: LISIS CELULAR: Métodos Físicos:

• Homogenización con
microtubo con perlas.
• Prensa, blender.
• Mortero con pistilo.
• Se usa en células sin pared SONICACIÓN
celular. CONGELACIÓN-
Consiste en suspender las células en DESCONGELACIÓN
una solución hipotónica causando
que el agua difunda al interior de la
célula, causando su hinchamiento y
posterior rotura

MÉTODOS DE HOMOGENIZACIÓN
El método de lisis a elegir dependerá de las características mecánicas del tejido o células de donde
se va a aislar la proteína, así como de su localización.
Lisis celular: para células sin pared celular como las células de tejidos animales.

MÉTODOS DE HOMOGENIZACIÓN: Congelación-descongelación

-Se somete las células a cambios bruscos de congelando temperatura, a -196 ́ C y pasándolas
rápidamente temperatura ambiente 25 ́C.
-Tras la rotura o durante el proceso se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas.
-Para purificar las proteínas asociadas a membrana, estos tampones pueden contener además
detergentes.

TODAS LAS ETAPAS DEL FRACCIONAMIENTO, INCLUIDAS LA HOMOGENIZACIÓN DE

LA MUESTRA DEBEN REALIZARSE EN HIELO

CENTRIFUGACIÓN

Ultracentrífugas. Analíticas: obtención de datos precisos de

Velocidad: a partir de propiedades de sedimentación (S, PM)
50,000 rpm. Presentan
sistemas auxiliares:
sistema de refrigeración Preparativas: Aislar partículas, células o
y sistema de vacío. moléculas para su análisis o utilización
posterior.

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD
Homogenizado celular que contiene partículas que difieren en masa, pero pueden ser similares en
forma y densidad (proteínas globulares y RNA).

GRADIENTE DE DENSIDAD (solución sacarosa concentrada)

-Permite purificar las fracciones de organelos enriquecidas que se obtuvieron con la centrifugación
diferencial.
-En esta los organelos se separan en función del coeficiente de sedimentación al ser centrifugados en
un gradiente de una sustancia densa como la sacarosa.
-Partículas de diferente tamaño se sedimentan debido al gradiente de distintos niveles, moviéndose
en bandas discretas

CENTRIFUGACIÓN ZONAL O DE VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN

(Ocupan un gradiente de concentración preformado)
-Separación en función del coeficiente de sedimentación (S), que depende de tamaño , forma y densidad
-El gradiente evita la mezcla por convección/difusión: bandas bien separadas.
-Se detiene la centrifugación antes de alcanzar el equilibrio
-Las partículas sedimentan a través del gradiente concentrándose en zonas o bandas discretas en
base a su coeficiente de sedimentación

El coeficiente de Sedimentación (s): tiempos característico y constante de cada partícula coloidal en

recorrer una determinada distancia al ser ultracentrifugada (se mide en unidades Svedverg, S) en
medio con cierta densidad.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD EN EQUILIBRIO (Centrifugación
isopicnica)
-Los componentes celulares migran de acuerdo a su densidad, independiente de su tamaño y forma.
-Aquí las muestras se centrifugan en un gradiente que contiene una alta concentración Sacarosa o
Cloruro de Cesio.
-En lugar de separarse por su velocidad de sedimentación, las partículas se centrifugan hasta que
alcanzan la posición de equilibrio, en la que su densidad es igual a la de la solución.

• El sedimento de la centrifugación a 15,000 g (mitocondrias, cloroplastos) es resuspendido y

bandeado en un tubo de centrífuga que contiene un gradiente de concentración creciente de sacarosa.
• Una centrifugación por varias horas hace que cada organelo migre y se ubique de acuerdo a su
densidad de equilibrio, permaneciendo allí.
PEQUEÑAS VESÍCULAS PUEDEN PURIFICARSE MEDIANTE LA UNIÓN DE UN Ac
ESPECÍFICO CONTRA UNA PROTEÍNA DE LA SUPERFICIE VESICULAR Y UNIDA A
CÉLULAS BACTERIANAS

La proteinz A ubicada en la superficie de la bacteria Staphylococcus aureus se une a ta región Fc

Sonstante del AC. Por lo tanto la proteína A interactúa con el AC unido a la proteína de la superficie
vesicular. Los complejos bacteria-vesícula serán recuperados mediante centrifugación a baja
velocidad.
• Homogenización
CÉLULAS O TEJIDOS • Centrifugación diferencial
• Centrifugación en gradiente
PEQUEÑAS VESÍCULAS Extracto crudo de proteínasDE
de densidadUN Ac
ESPECÍFICO CONTRA UNA PROTEÍNA DE LA SUPERFICIE
VESICULAR Y UNIDA A CÉLULAS BACTERIACÉLULAS O
Fracciones subcelulares
(organelos puros o mezclas de organelos)
TEJIDOSNA

Extracción de proteínas/ADN
MITOCONDRIAL, ETC.
• Buffer de lisis
Extracto crudo de proteínas • Sonicación
• Centrifugación

Separación y purificación de proteínas

Separación de proteínas
• Cromatografías
• Electroforesis

SEPARACION DE PROTEINAS POR TECNICAS CROMATOGRAFICAS

TECNICAS ELECTROFORETICAS
CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA
• PESO/MASA
• CARGA NETA
• AFINIDAD
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS: FILTRACIONAMIENTO EN GEL
Separa proteinas de acuerdo a su masa. Proteínas mas pequeñas viajan a traves de la columna mas
lento que las más grandes.

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS:

INTERCAMBIO IÓNICO
-Separa proteínas que difieren en su carga neta, empleando columnas constituidas por bolitas o
cuentas que llevan una carga positiva/negativa.
-Las proteínas unidas se eluyen haciendo pasar por un gradiente salino (NaCI) a través de la
columna.

AFINIDAD (ANTICUERPOS)
-Ac unido covalentemente a las esferas que constituyen columna.
-Las proteínas con afinidad por el Ac. Seran retenidas por la columna las demás proteínas fluirán a
través de la columna.
-Las proteínas unidad son eludidas con unas solución ácida cambia conformación de los Ac y separa
los complejos Ag-Ac.

Si es una proteína con actividad enzimática, puedo agregar el sustrato para la enzima en la esfera.

Purificación de proteínas por cromatografía

Una vez extraídas las fracciones proteicas se hizo pasar a través de:
A) Una columna de intercambio iónico. Las proteínas de interés fueron eluidas en varias fracciones
y detectadas por su actividad enzimática.
B) Las fracciones con actividad fueron puestas en una 2da columna: Cromatografía de Gel-
filtración. Nuevamente la posición de la proteína, aún impura, se determinó por su actividad
enzimática.
C) Las fracciones se hacen pasar por la columna de Afinidad, esta contiene el sustrato inmovilizado
de la enzima de interés.
D) El grado de purificación de las fracciones obtenidas de la columna anterior analizada mediante
Electroforesis en GEL-SDS (teñido con Azul de Coomassie).