PRACTICA N° 2

EXTRACCION Y PURIFICACIÓN DE DNA

INTRODUCCION
Las características de un organismo están especificadas en su información genética,
la cual está representada como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma
total de esta secuencia es lo que conforma su genoma. Dentro de los procedimientos
en biología molecular, el más básico es la extracción y purificación de ácidos
nucleicos, en la forma de DNA o RNA. Por lo tanto se requieren métodos seguros
para la separación de estos componentes de las células. Para lograr esto, se utilizan
diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear, fresco, seco
o congelado.

Diferentes métodos y tecnologías están disponibles en el mercado para realizar el

aislamiento de DNA genómico, aunque todos conservan el uso de los mismos
principios y fundamentos. En términos generales, la obtención de DNA a partir de
leucocitos totales (obtenidos de sangre periférica), células en cultivo, tejidos animales,
vegetales, levaduras y bacterias; se usa generalmente una técnica de cuatro pasos
secuenciales:
a. Disrupción o alteración de la membrana
b. Lisis
c. Remoción de proteínas y contaminantes
d. Recuperación del DNA

El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material

inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El método utilizado para
romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor
daño posible al DNA. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica,
pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la
degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con detergentes
de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos
involucran una desproteinización, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico,
seguido de una precipitación con isopropanol o etanol y posterior solubilización con
agua o tampón.

El uso del protocolo de extracción con fenol/cloroformo ha sido el método más usado
para obtener DNA genómico. Estos protocolos tienen buenos resultados para
muestras de diversos orígenes. Sin embargo, es un método lento, laborioso y
contaminante. La extracción de DNA usando el protocolo con sal común (NaCl) es
una alternativa simple, fácil, rápida y no contaminante que permite obtener DNA de
buena calidad, en cantidades suficientes, desde diferentes muestras de tejido vegetal,
animal o bacteriano (Lopera-Barrero et al., 2008).
El DNA purificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en
diferentes aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión con
endonucleasas de restricción, Southern blot y Dot blot.

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OBJETIVO

 Identificar las etapas indispensables en los protocolos de extracción de DNA

 Comparar algunas técnicas de extracción de DNA
 Realizar un procedimiento modelo para la obtención de DNA

METODOLOGÍA

Muestras biológicas se colocarán en microtubos Eppendorf para ser tratadas con 550 μL
de solución tampón de lisis o TNES/protK (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0 (+) 50 mM de EDTA
(+) 100 mM de NaCl (+) 1% de SDS (+) 7 μL de 200 μg·mL -1 de proteinasa K (autoclave
TNES, almacene en refrigeración y adicione protK antes de uso). Inmediatamente se
incubará en baño termoregulado a 50°C por 12 h. Luego, se adicionarán 600 μL de NaCl
5M a cada muestra antes de centrifugar por 10 min a 12000 rpm. El sobrenadante se
transferirá a microtubos nuevos, donde se precipitará el DNA con 700μL de etanol
absoluto frío y posteriormente se incubará a -20°C por 2 h. Las muestras de DNA serán
centrifugadas, lavadas con 700 μL de etanol 70% y resuspendidas en tampón TE (10 mM
de Tris pH 8.0 y 1 mM de EDTA) (35 a 80 μL) y luego será tratada con 30 μg·mL -1 de
ARNsa e incubado en baño de agua por 40 min a 37°C. El DNA obtenido se conservará a
-20°C.
La cantidad y calidad del DNA obtenido se determinará con un espectrofotómetro con una
absorbancia de 260/280 nm. Para esto, muestras de DNA se diluirá a 10 ng·μL -1 en
tampón TE.

CUESTIONARIO

1. ¿Características diferenciales DNA, cromosomas, organelos involucrados de

células procariotas y eucariotas?.
2. Hay muchos métodos de extracción de DNA que usan buffer de lisis y que
contiene principalmente EDTA y SDS. ¿Cuál es la función de estos dos reactivos
dentro de este contexto?.
3. ¿Qué tipo de enzima se emplea para realizar la remoción de proteínas?. Cual es el
fundamento de este procedimiento.

Las enzimas más comúnmente utilizadas para este propósito son la proteinasa-K y
la tripsina. La proteinasa K es una serina proteasa que es capaz de degradar
proteínas e inactivar DNasas y RNasas. También degrada las nucleasas que
pueden estar presentes durante la extracción del ADN y protege los ácidos nucleicos
del ataque de las nucleasas. Mientras que la tripsina es una enzima que
específicamente degrada proteínas que contienen enlaces peptídicos de lisina o
arginina. Es importante tener en cuenta que la elección de la enzima dependerá
del tipo de muestra y del protocolo de extracción de ADN utilizado (Castaño et al.,
1996).

4. La recuperación del DNA se puede realizar mediante diferentes métodos, los más
comunes son: Salting-Out, extracción orgánica con fenol-cloroformo, gradientes de
densidad de cloruro de cesio, métodos basados en sílica-gel o resina quelante
(Chelex). ¿Diga cuál es el principio de cada uno de ellos?. Ventajas y desventajas.

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5. Describa un método de extracción de DNA y fundamente la razón del uso de cada
reactivo y de las condiciones del proceso (temperatura, pH, sal, etc.).
6. Que actividades particulares deben tener las técnicas de extracción de DNA
según: organelos (núcleo, cloroplasto), tejido, célula (animal, fago, bacteria,
planta), estructuras genéticas (cromosoma, plásmidos,). En todos casos incluir las
referencias bibliográficas consultadas.
7. Porque el DNA se lee 260-280 nm?.

BIBLIOGRAFIA

- Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega,

Biorad, Biologend, Bioline, etc.
- David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology.
Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986.
- Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons,
1988.
- Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2 edition, Col
nd

Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

https://www.youtube.com/watch?v=nXeB1Ib13P8

https://www.youtube.com/watch?v=JAj60HTpto0

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