Universidad Autónoma de Nuevo León.

Facultad de Ciencias Biológicas.

Virología.

Práctica 1. EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE MATERIAL

GENÉTICO VIRAL

Alumno.

Elvin Eliezer Altamirano Toledo. - 1798353.

Grupo: 272

Facilitador: Juan Francisco Contreras Cordero

San Nicolás de los Garza, Nuevo León. A 25 de octubre del 2021.

 Práctica 1. EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO VIRAL

Etapa 2: Asociar la función de las moléculas virales en los procesos de replicación

viral y alteración de las funciones celulares.

1. Elementos de competencia: Evaluar los marcadores moleculares específicos

de virus humanos y animales para proponer técnicas de diagnóstico clínico en
enfermedades virales.

2. Propósito de la práctica:
 Conocer y realizar la técnica de extracción de RNA total por el método: Fenol

– Cloroformo.

 Conocer las ventajas, desventajas y aplicaciones de esta metodología.

 Conocer y realizar la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE) además de su tinción con nitrato de plata.

 Sea capaz de interpretar los resultados obtenidos durante la sesión.

 Realice buenas prácticas de laboratorio durante toda la sesión.

3. Introducción
Los métodos de purificación de material genético dependen del tipo de muestra, la
naturaleza de la misma y el procedimiento que se le dará después de su purificación.
Actualmente se manipulan diferentes variaciones de la técnica que fundamentalmente
siguen los mismos pasos: La liberación del material genético destruyendo la cápside
virus y la membrana de los virus envueltos, así como la membrana celular y
membrana nuclear de células infectadas. Este paso generalmente se realiza con una
solución de extracción que contiene diferente elementos que tienen funciones
particulares: detergentes (SDS, Tritón X), que funcionan disolviendo la membrana o
participando en la desnaturalización de proteínas; moléculas quelantes que tienen
cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma completamente
desprotonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución y
desestabilizar las membranas celulares (EDTA, ácido etileno amino tetracético); sales
(NaCl) que forman una capa iónica suave que recubre el material genético
protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación; un
buffer estabilizador de pH (Tris-HCl) y enzimas que eliminen las proteínas de la
solución (Proteinasa K). La muestra es sometida a períodos de incubación en
hielo, alternándolo con la agitación de la muestra (manual, en vórtex o en
homogenizadores celulares utilizando microesferas) para facilitar la ruptura y
permitiendo una eficiente liberación de los ácidos nucleicos.
Posteriormente se realiza la eliminación de proteínas utilizando una solución de
fenol y cloroformo, el fenol y el agua no se pueden mezclar debido a que el fenol
es un compuesto orgánico y el agua es polar, debido a la polaridad del material
genético, este permanecerá en la fase acuosa de la solución. Por su parte, las
proteínas conformadas por grandes cadenas de aminoácidos (algunos polares y
otros no) quedarán en la interfase y en la fase orgánica (fenólica). Es por ello que
en este paso se obtiene el sobrenadante cuidando no tomar nada de la interfase
para no arrastrar proteínas que interfieran con la purificación.

Finalmente se realiza la precipitación del material genético obtenido, esto se

realiza adicionando a la fase acuosa una sal a alta concentración (acetato de
sodio, cloruro de sodio o acetato de amonio), esto con la finalidad de conferir una
capa iónica positiva al material genético que permitirá precipitarlo fácilmente con
etanoles, que a su vez se utiliza en múltiples lavados para eliminar las sales en
solución. Al manipular muestras con baja concentración de material genético, se
utiliza un volumen igual al de la fase acuosa de isopropanol, en lugar de dos
volúmenes de etanol. Esto debido a que solubilidad del material genético es menor
en isopropanol, por lo que se precipitación será de mayor concentración y más
rápidamente. Debido a que también se lleva a cabo la precipitación de sales, es
necesario realizar lavados con etanol al 70% para eliminarlas, asimismo, se debe
eliminar el exceso de etanol para resuspender la pastilla de material genético en
agua nanopura y almacenarlo a -70°C hasta su uso.

En la actualidad se comercializan paquetes comerciales donde se simplifica el

proceso de purificación utilizando columnas equipadas con membranas de sílice
para retener el material genético permitiendo el paso de proteínas, lípidos y sales
que se obtienen de la fase de lisis. Por lo que realizan lavados en la columna y
finalmente eluyen el material genético purificado.

Concentración y calidad del ácido nucleico obtenido:

Tras la extracción del ácido nucleico de interés se debe realizar una evaluación de la
calidad y concentración del mismo. Para ello se puede valorar la absorbancia de la
disolución del material genético obtenido por el proceso de extracción en un
espectrofotómetro. La densidad óptica a la que debe medirse es 260 nm y 280 nm
donde se determinará una relación A260/A280. Un ADN puro tiene un valor entre 1.8
y 2, mientras que el ARN deberá tener valores alrededor de 2. Valores menores
indican presencia de proteínas que pudieran interferir con loa análisis posteriores,
mientras que valores mayores se deben a contaminación con sales. Para calcular la
concentración del ADN se mide su absorbancia a 260 nm, ya que está estabecido que
una absorbancia de 1 en esta longitud de onda corresponde a 50 µg/ml de ADN, en el
caso de ARN una absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 40 µg/ml.
Con esta relación se puede calcular la concentración de ADN en la muestra. La
capacidad de absorber fotones de luz de las bases nitrogenadas es lo que permite
realizar esta lectura por absorbancia. No obstante, existe otro método que nos permite
visualizar el material genético, la electroforesis. La electroforesis, es una técnica que
utiliza un campo eléctrico para separar moléculas, en función de su tamaño, carga y
forma. El ADN y el ARN que poseen una carga negativa, migran del cátodo al ánodo a
través de una malla tridimensional de un polímero cuya composición puede variar
(Agarosa, poliacrilamida), la fricción hará que las moléculas de menor tamaño migren
rápidamente y avanzarán más en el gel, mientras que las de mayor tamaño, migrarán
más lentamente. La electroforesis en agarosa, permite separar fragmentos de ADN
cuando no requerimos de una alta resolución. Eso debido a que solo se pueden
separar moléculas que difieren de 50 pb entre ellas. No obstante, el rango de tamaños
que pueden separarse es mayor que la poliacrilamida (50 pb – 40 kb) dependiendo de
la concentración de agarosa. Este rango de tamaños permite utilizar geles de agarosa
para analizar el producto de digestiones enzimáticas, productos de PCR, etc. Los
geles de agarosa
convencionales se utilizan en una cámara de electroforesis horizontal, con un campo
eléctrico uniforme, constante y requiere una tinción con agentes intercalantes de los
ácidos nucleicos para poder visualizar las bandas bajo la luz UV. Por su parte, la
electroforesis en geles de poliacrilamida da un mejor poder de resolución, que
dependiendo de las condiciones de la electroforesis permiten la separación de
moléculas que difieren hasta en un solo par de bases. Los geles de poliacrilamida se
corren de forma vertical. La visualización del ADN se puede realizar con agentes
intecalantes como los utilizados en la electroforesis en agarosa o con una tinción con
nitrato de plata donde se utiliza un agente reductor para volver visible la plata reducida
y depositada alrededor de la molécula de ADN.

Aplicaciones en Virología:

En la virología, las aplicaciones de las técnicas de biología molecular son múltiples.

Se pueden utilizar para diagnóstico o para estudios genéticos en múltiples campos.
Se puede identificar el agente causal de una enfermedad, o identificar variantes de
virus. Es importante determinar el tipo de muestra que se manipulará durante el
estudio, lo cual depende en gran medida por el agente infeccioso. Un ejemplo es el
virus Influenza A que es un virus de ARN que afecta las vías respiratorias de
mamíferos y el tracto digestivo de aves. Por lo que, dependiendo del hospedero, es la
muestra que se requiere colectar. Por su parte, rotavirus produce un cuadro de
gastroenteritis en niños pequeños, se requiere esencialmente muestras de heces
(para la detección del genoma). La calidad y utilidad del análisis depende en gran
medida, de la toma, conservación y envío de las muestras antes de llegar al
laboratorio. Todas las muestras deben identificarse con fecha, código de identificación
y laboratorio responsable de la muestra. Las muestras pueden ser utilizadas para el
diagnóstico clínico, identificación y/o preservación de cepas virales. La probabilidad de
aislar partículas virales depende de la distribución del agente etiológico dentro del
organismo infectado ya que una vez que se presenta el proceso de infección, el
sistema inmune del hospedero busca eliminarlo por lo que es vital determinar el
período de tiempo de la toma de la muestra y el inicio de la infección. La fase aguda
es un buen indicio, aunque hay virus que se pueden seguir
 secretando después de la recuperación del organismo. Durante esta práctica, se
realizará extracción de RNA por el método fenol - cloroformo tomando como
modelo de estudio un virus con genoma de RNA de doble cadena segmentdo,
Posteriormente se determiná la calidad del genoma a través de una electroforesis
en un gel de poliacrilamida al 10% y teñido con nitrato de plata.

4. Desarrollo de la práctica

Material de laboratorio

Extracción de RNA viral:

 Heces PBS 20%/Lisado celular c/ virus

 Buffer Lisis

 Fenol Saturado c/Tris pH 8

 Cloroformo

 Etanol Frío

 Agua nanopura

 Vortex

 Centrífuga

 Congelador -20°C

 Tubos cónicos 1.5 ml

 Micropipeta

 Puntillas 500 µl

 Papel secante

 Recipiente desechos biológicos
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

  Acrilamida – bis 30%
 Tris – HCl pH 8.8

 Agua bidestilada

 Persulfato de amonio

 TEMED

 Buffer Corrimiento (Buffer Tris – Glicina 1X)

 Buffer de Carga (Azul de bromofenol)
  Cámara de electroforesis

 Fuente de poder

 Micropipeta

 Puntillas 1-20 µl

Tinción de nitrato de plata

 100 ml solución fijadora (Alcohol etílico 10% + Ac. Acético 0.5%)


 100 ml solución de nitrato de plata 1X

 100 ml de solución reveladora (7.5 ml de NaOH 10 M + 1.5 ml formaldehído)

 50 ml de solución de contraste (ac. Acético 5%)

 Recipiente

 Piceta

 Papel secante



5. Actividades a desarrollar:

Extracción de RNA total por el método fenol-cloroformo (Figura 1):

1. Homogenizar la muestra. En caso de la suspensión de heces al 20% agitar dos

minutos en vortex y centrifugar a 12,000 rpm por 5 minutos.
2. Tomar 200 µl del sobrenadante y transferirlo a un tubo cónico de 1.5 ml limpio y
etiquetado.
3. Adicionar 200 µl de buffer de lisis y agitar en vortex por dos minutos.
4. Añadir 200 µl de Fenol Saturado con Tris pH 8. (ATENCIÓN: ESTE REACTIVO
SÓLO PUEDE SER MANIPULADO POR EL INSTRUCTOR UTILIZANDO
GUANTES).
5. Agitar en vortex por un minuto.
6. Añadir 200 µl de cloroformo y agitar en vortex dos minutos.
7. Centrifugar el tubo a 14,000 rpm durante 5 minutos y observar la formación de
las fases.
8. Tomar la fase acuosa teniendo cuidado de no tomar NADA de la interfase y
transferirlo a un tubo limpio previamente etiquetado.
9. Añadir 1 ml de etanol frío y agitar por inversión 3 veces.
10. Incubar a -20°C toda la noche.
11. Al finalizar el tiempo de incubación, centrifugar a 14,000 rpm durante 15 minutos.
12. Eliminar el Etanol y secar suavemente con papel secante.
13. Resuspender con 30 µl de agua nanopura.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida 10% (Figura 2):

1. Armar la cámara de electroforesis utilizando vaselina para sellar los bordes del
vidrio, sujetar con pinzas en los costados para posteriormente sujetarlo en el
soporte de geles.
2. Preparar el gel de poliacrilamida según la concentración deseada y montarlo en
la cámara.
3. Adicionar a la cámara 300 ml de Buffer de Corrimiento 1X hasta llegar al borde
de los vidrios.
4. Utilizar 3 µl de buffer de carga por muestra añadiendo 10 µl de RNA purificado.
5. Correr a 100 -115 Volts constantes por 4 horas.
 Figura 1. Estrategia experimental de la extracción de RNA total por el método fenol-
cloroformo.

Figura 2. Montaje de cámara de electroforesis vertical.

Tinción Nitrato de Plata (Figura 3):

1. Desmontar el gel de la cámara de electroforesis y con cuidado desprender de los

vidrios para posteriormente depositarlo en un recipiente de plástico.
2. Añadir 100 ml de solución fijadora depositándola desde la esquina del recipiente.
Incubar por 30 minutos.
3. Añadir 100 ml de la solución de nitrato de plata 1X e incubar el gel en oscuridad
por 30 minutos.
4. Añadir la solución reveladora y dejarla actuar hasta observar la nitidez de las
bandas obtenidas. Contrastar el gel con la solución de contraste.
5. Detener la reacción con agua bidestilada.

Figura 3. Metodología utilizada para la tinción del gel de poliacrilamida con nitrato
de plata.

6. Evidencias

Resultados: Reportar los resultados obtenidos durante su práctica utilizando

elementos visuales como fotografías o dibujos, de tal manera que se realice una
descripción de lo observado para su posterior discusión.
Fig. 1 En el primer carril se encuentra el control positivo, mientras que el resto son
muestras problema. Las muestras son suspensiones de heces al 20% en PBS de niños
con gastroenteritis entre 3 y 5 años.

Tabla 1. Pureza del RNA obtenido de muestras de heces al 20% en PBS de niños con
gastroenteritis entre 3 y 5 años.

7. Discusión: Realizando una consulta de literatura, elaborar la discusión de los

resultados obtenidos durante la sesión práctica.
En las infecciones de rotavirus es muy conocido que se presenten cuadros de
diarrea que hacen que el virus pueda expulsarse, de este modo su análisis se
facilita en este fluido mediante inmunoensayos como lo es la electroforesis del
genoma viral utilizada en esta práctica.
En este caso, como resultado de la electroforesis, aparecieron muestras positivas
para rotavirus, estas muestras se expresaron por electroferotipo, y había 11
fragmentos de dsRNA distribuidos en 4, 2, 3 y 2. Como se describe en general, el
patrón de banda costera de rotavirus, 4 de alto peso molecular, 5 de tamaño
mediano, de los cuales hay tríadas características formadas por los segmentos 7,
8 y 9; y dos segmentos de mercado considerados más pequeños (López & Arias,
2001).
El estudio de integridad por electroforesis es el complemento al análisis integral de
cantidad y calidad del ARN, necesario para llevar a cabo la transcripción inversa y
las posteriores PCRs de manera exitos. La obtención de ARN de alta calidad es la
base de muchas investigaciones de biología molecular la RT-PCR, la síntesis de
ADNc y el posterior análisis genético, requieren ARN con alta pureza e integridad
(Cervantes, 2018), en la Figura 1, se puede observar la purificación del ARN. El
proceso de extracción manual también afecta el rendimiento por el exceso de
manipulación y durante sus diferentes pasos: extracción fenol-cloroformo,
centrifugación, decantación, lavado, disolución, precipitación en frío, entre otros,
se puede degradar y perder parte del material.
El estimado de pureza que brinda el equipo da información acerca de la presencia
de proteínas, lo cual es útil para conocer la eficiencia del proceso de extracción
(Meyerson, 2010). La pureza de las muestras utilizadas se considera que solo las
muestras 2 y 3, que presentan una relación en cuanto a la A260/A280, que fue de
1.8 y 2.0 respectivamente, por su parte las muestras 1, 4 y 5 presentaron valores
de 1.6, 1.5, 1.3 se considera que son muestras contaminadas ya que sus valores
se encuentran por debajo de la referencia.
 8. Conclusiones: En base a lo observado, escribir las conclusiones más
importantes obtenidas de la práctica de laboratorio, así mismo evidenciar la
obtención de la competencia.
En cuanto a los resultados obtenidos a través de la práctica, es posible determinar
qué muestras son virus típicos de rata, teniendo en cuenta su electroferotipo, para
identificar los 11 fragmentos que los presentan y su distribución. Y de acuerdo con la
relación A260 / A280 para comprender la pureza de la muestra, porque esto nos
permitirá conocer la confiabilidad de los resultados de la prueba, así como el motivo
de la contaminación de la muestra, que generalmente se debe a la presencia de
compuestos aromáticos.
El diagnóstico oportuno de rotavirus en los laboratorios hospitalarios permitirá
ampliar la investigación epidemiológica y permitirá que los pacientes afectados
reciban determinados tratamientos especiale
9-. Cuestionario: Contestar brevemente las siguientes preguntas.

Menciona otras técnicas utilizadas en la purificación de material genético a

partir de diferentes tipos de muestra (sangre, moco, tejido, micelio, hojas de

plantas, etc.)

• Método del acetato de potasio

• Método del acetato de potasio modificado.
• Método de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB)
• Método de adsorción en columna de sílice utilizado en sangre periférica,
muestras de saliva y tejido.
• Método de purificación por unión a microesferas magnéticas. Muestras de sangre,
saliva, tejido fresco, líquido admitido.

¿Por qué durante la tinción de nitrato de plata se lleva a cabo un paso fotosensible?

Ya que este es un agente oxidante, puede oscurecer si la luz brilla sobre él.

Menciona otros métodos de cuantificación de material genético y la

importancia de su calidad.

• PCR “Real time”: amplifica el AND con el uso de oligonucleótidos como primers,
se basa en la bioquímica de los ácidos nucleicos.
• Secuencias cortas repetidas en tándem (STR’s): su metodología es rápido,
evalua cantidades muy pequeñas de ADN, es tolerante al ADN degradado, permite la
automatización, permita la construcción de escalas alélicas.
• Amelogenina: es muy sensible y sirve como control positivo.
• Cuantificación por espectrofotometría. También permite estimar la cantidad de
ARN presente en el extracto, la absorbancia del RNA se puede analizar en términos de
proporciones.
 ¿Qué es un electroferotipo?

Consiste de un grupo de cuatro segmentos de ARN de alto peso molecular. 5

segmentos de tamaño mediano que incluye un triplete muy característico formado por
segmentos de dos más pequeños

¿Qué tipos de electroferotipos se han determinado?

De tipo largo y corto. Siendo el principal el de rotavirus teniendo un grupo de cuatro

segmentos de ARN (1-4); cinco segmentos de tamaño mediano (5-9). De otros virus
pueden recuperarse electroferotipos a partir de la separación electroforética, pero han
sido tan descritos en comparación con el del rotavirus.

¿Qué otros agentes virales se pueden detectar por esta técnica

ADN-RNA

Menciona una técnica de biología molecular que se podría utiizar una vez
obtenido el material genético purificado.
Reacción en cadena polimerasa (PCR).

¿Cuál es el nivel de bioseguridad del virus Influenza A, Rotavirus, Zikavirus,

Herpesvirus y Ébolavirus?
Influenza A – bioseguridad nivel 3
Rotavirus – bioseguridad nivel 2
Zikavirus – bioseguridad nivel 2
Herpesvirus – bioseguridad nivel 2
Ebolavirus – bioseguridad nivel 4
10. Problemas:

En base a las absorbancias de las siguientes muestras purificadas, ¿cuál es la concentración que
presentan? ¿cuál muestra presenta una mejor calidad de purificación? ¿Porqué?

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

RNA DNA RNA

A260: 1.82 A260: 1.24 A260: 1.9

A280: 1.34 A280: 0.89 A280: 0.95

Concentración Muestra 1:
A260:
1= 40 μg/ml
1.82=X μg/ml
X=(1.82)(40)/1
X= 72.8 μg/ml
Concentración Muestra 2:
A260:
1= 50 μg/ml
1.24=X μg/ml
X=(1.24)(50)/1
X= 62 μg/ml
Concentración Muestra 3:
A260:
1= 40 μg/ml
1.9=X μg/ml
X=(1.9)(40)/1
X= 76 μg/ml
La muestra que presenta una mayor calidad es la Muestra 3 ya que su relación 260/280 se
encuentra dentro del rango de 1.8 y 2.
¿Cuál es el volumen necesario de Acrilamida-bis 30% para preparar un gel al 15%
de concentración?
V1C1=V2C2
(V1)(30%)=(20μl)(15%)
V1 = (300)/(30)
V1=10 μl
¿Cómo se prepara el buffer de corrimiento Tris-Glicina 1X si parto de un stock 30X y
requiero 300 ml?
C1V1=C2V2
30X=300ml
1X= X
(1) (300)=(30)(X)
X= (1)(300)/30
X= 10 ml

¿Cómo se prepara la solución de nitrato de plata si parto de un stock 100X?

C1V1=C2V2
100X= 100ml
1X= X
(1)(100)=(100)(X)
X= (1)(100)/100
X= 1 ml
Literatura consultada

 Cervantes, L; De Jesús, M; González, D; et. al. (2018). Evaluación de tres

protocolos para la extracción rápida de ARN total de tejidos de Prosopis
juliflora (SW). Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas. 9(6): 1259-1267.
Recuperado el 20 de octubre de 2021, de:
http://www.scielo.org.mx/pdf/remexca/v9n6/2007-0934-remexca-9-06-1259.pdf
 López, S. & Arias, C. (2001). Los rotavirus.
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap17/
 Mayo Foundation for Medical Education and Research (MFMER). (2019, 20
junio). Rotavirus - Síntomas y causas - Mayo Clinic. Mayo clinic. Recuperado
25 de octubre de 2021, de https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-
conditions/rotavirus/symptoms-causes/syc-20351300
 Meyerson, M., Gabriel, S., & Getz, G. (2010). Advances in understanding
cancer genomes through second-generation sequencing. Nature Reviews
Genetics, 11(10), 685-696.