UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA QUÍMICA Y FARMACIA

FECHA: 19/08/2021 TEMA: Extracción del ADN. VEpVERSION #1

Objetivo General: Comprender y analizar cómo se realiza la extracción generalizada del ADN.
Objetivo Específico.
✓ Relacionar los métodos de extracción expuesto con la extracción generalizada del ADN.
✓ Observar los protocolos y las etapas que se realizan en la extracción de ADN.

Marco Teórico.

Extracción de ADN.

El análisis de la alteración genética entre individuos,

poblaciones y especies para describir patrones y procesos ecológico-

evolutivos se aborda por medio de marcadores moleculares,

segmentos de ADN.

Estos marcadores se obtienen con técnicas como la PCR y

secuenciación, que realizan viable examinar la alteración en la molécula del ADN con un detalle sin

antecedentes.

Se le llama extracción al procedimiento por el que se recibe el ADN desde material biológico usando

técnicas físicas y químicas.

La extracción se basa en la aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se fundamenta en las

propiedades fisicoquímicas de la molécula. (Rojas, 2020)

4 ejemplos para la extracción del ADN.

1. Método de extracción fenol – cloroformo

Es principalmente el más usado y conlleva buenos resultados. Es un procedimiento subjetivamente

sencillo, eficaz para muestras de cualquier origen y de

bajo precio, no obstante, se usan sustancias tóxicas que

tienen la posibilidad de ser peligrosas si no se siguen los

métodos adecuados por el investigador.

Diversos compuestos intervienen en el protocolo

de sustracción, uno de ellos

es el compuesto orgánico tris hidroximetil aminometano, con un pH entre 7 y 9

aporta capacidad tamponante positiva, se usa para elaborar disoluciones tampón.

Otro compuesto es, el ácido etilendiaminotetracético o EDTA, se usa como

representante quelante debido a que tiene la función de conformar ligandos para

generar compuestos metálicos más estables, dichos complicados se utilizan para

conformar disoluciones como; TAE, TEN y TE.

En la sustracción y purificación del ADN para desestabilizar las membranas

celulares, se ocupa un detergente, dodecilsulfato sódico o mejor conocido como

SDS, un tensoactivo aniónico con alta concentración de sales y al igual que el fenol

ayudan a desnaturalizar las proteínas que contaminan la muestra. Después actúa la

RNAsa una enzima que inhibe la hidrólisis del ARN. y la suma de cloroformo posibilita la división de 2 etapas,

una acuosa que tiene el ácido nucleico y una orgánica que tiene proteínas y otros contaminantes disueltos, los

ácidos nucleicos se precipitan utilizando etanol o isopropanol.

En el protocolo se necesita aumentar pasos extras como, hacer diversos lavados con fenol cloroformo o

filtraciones con columnas concretas, además puede contener inhibidores que intervienen en la actitud de PCR,

como el fenol o el cloroformo.

2. Método de extracción PureLink TM microbiome.

Pertenece a los kits comerciales que dan una purificación de ácido nucleico microbiano de forma

instantánea y eficiente. Este procedimiento está creado para la

cuarentena y purificación de ADN desde una extensa variedad

de muestras, incluyendo muestras difíciles de laborar como

tierra y heces, el kit cuenta con la tecnología de una columna

giratoria que posibilita obtener un ADN robusto y purificado

que está listo para tratamientos siguientes como PCR o

secuenciación.

El inicio del kit se fundamenta en la selectiva alianza que tiene el ADN con la membrana que está

realizada a base de sílice en presencia de sales caotrópicas, proviene con una lisis triple que provoca que sea

enormemente eficiente, remueve inmediatamente los inhibidores y es apto para indagaciones con microbiomas

gracias a su versatilidad, además puede identificar eficientemente bacterias patógenas desde un muestreo

variado.

Las propiedades del kit de sustracción integran; una limpieza completa de inhibidores debido a su

precipitación con tampón de aseo, una lisis eficiente para microorganismos, el desarrollo del protocolo de

sustracción se hace en tiempos cortos inclusive haciendo un trabajo con numerosas muestras a la vez y se recibe

un ADN de alta pureza, las muestras que son eficientes para el kit de sustracción PureLikn TM son; heces, orina,

suelo, hisopos, medios de transporte, medios de incremento y saliva. (Quezada, 2020)

Agrego un Link acerca de un video explicativo donde se observa la extracción de ADN por este método:

https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880
3. Chelex.

Técnica inorgánica. Es un copolímero quelante de iones metálicos como el Mg2+ inactiva las DNasas

y otras enzimas que pueden interferir en la PCR y otras aplicaciones basadas en enzimas ligación, etc.

Elimina eficientemente los productos de la lisis celular (fuentes de ADN:

sangre total, bacterias y cultivo de células).

Los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN. Pueden utilizarse en

muestras con ↑[sales].

Ventaja: económica, sencilla y rápida (un simple paso de ebullición en presencia

de la matriz, se utiliza el SN directo en la PCR).

Desventajas: ADN aislado es de cadena sencilla (desnaturalizado),

utilizado en PCR, pero no en RFLPs.

4. Papel FTA.

Papel almacenaje a base de celulosa. Estable a RT por años. Utilizada para muestras de sangre o saliva

de víctimas o sospechosos.

Cuantificación no es necesaria: cantidad de muestra consistente, más bien existe una posible

automatización.

Rompe células y membranas de organelos. Físicamente Atrapa Ácidos Nucleicos (ADN & ARN)
 Preserva y protege Ácidos Nucleicos, previene Daño por radicales libres/UV,

Previene Daño Enzimático (nucleasas) e Inhibe

crecimiento de hongos y bacterias.

Provee Seguridad al Usuario -Inactiva

Potenciales Virus Peligrosos. Se añade directamente el

papel lavado (para remover HEME y otros inhibidores) a la mezcla de PCR

PAPEL FTA. (Lizeth, 2019)

Protocolos de extracción tradicional y comercial.

Protocolo tradicional.

Precipitación del ADN.

Luego de que son destruidos los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para eso, se adiciona

etanol y resoluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se integran a los equipos

fosfato, esta mezcla disminuye las fuerzas repulsivas en medio de las cadenas y posibilita que el ADN se

pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación posibilita que el ADN permanezca en

el fondo del tubo mientras tanto que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado

con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación.

 Separación de proteínas y lípidos.

En este periodo se separa el ADN de las proteínas y lípidos por medio de solventes orgánicos y ciclos

de centrifugación. Se usa la profundo tendencia hidrofílica de los equipos fosfato para separarlos en medios

acuosos, a medida que las proteínas y los lípidos se dividen en solventes orgánicos. La etapa acuosa y la

orgánica se parten por centrifugación lo cual posibilita aislar al ADN. Los solventes que se utilizan muchas

veces son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico. Dichos reactivos contaminan de forma sencilla el

ADN, por lo cual se debería eludir acarrearlos en el proceso de purificación

Redisolución del ADN.

Cuando se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para mantenerlo en solución.

En la situación de usar agua, el pH debería ser de 7 para permitir la redisolución completa del ADN y evadir

una hidrólisis ácida, consultado en agosto del 2010). Una vez que se usa una solución amortiguadora, es

preferible usar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 para guardar el material.

Una vez que se está disolviendo el ADN es fundamental evadir el pipeteo y la agitación agresiva puesto que

tienen la posibilidad de fragmentar moléculas de elevado peso molecular. Una alternativa que previene la

fragmentación se apoya en incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave. (Velázquez, Martínez, &

Romero., 2004)

Protocolo comercial.

Unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado.

En la situación del kit con membrana de sílice, en algunas ocasiones a la mezcla de lisis se le incorpora

la solución de alianza que tiene un pH específico. Anterior a pasar la solución de lisis por medio de la

columna, se adiciona etanol a la solución, eliminando la capa hidratante del ADN y exponiendo sus equipos

fosfato, haciendo más fácil con ello la adsorción de la molécula a la membrana cargada de manera positiva.
 Los lípidos y proteínas no son afines a la membrana y se eliminan con ayuda de la solución de lavado

y un periodo de centrifugación, en lo que el material genético permanece unificado a la matriz (2B).

El kit con perlas magnéticas además de usar resoluciones a pH específicos, usa un imán o magneto que

interesa a las perlas para separarlas de las resoluciones en las que se hallan suspendidas. En esta situación, se

incorpora a la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que posibilita cargar de manera

positiva a las perlas, favoreciendo la alianza de ADN. Las proteínas y lípidos poseen baja afinidad por las

perlas y son destruidos con resoluciones de lavado a pH fisiológico. Las perlas son retenidas en el muro del

microtubo con el magneto, en lo que la solución con los contaminantes se elimina por pipeteo (2B).

Recuperación del ADN de la matriz.

En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz. La membrana y el ADN se deshidratan con

soluciones de lavado y ciclos de centrifugación, después se recomienda centrifugar nuevamente la columna

para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las soluciones. Posteriormente, se adiciona agua o solución

amortiguadora al centro de la membrana, se espera a que el ADN se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de

la matriz y suspenderlo.

En el protocolo de perlas magnéticas se utiliza una solución básica de Tris-HCl 10 mM a pH 8.5 para

neutralizar la carga de las perlas. El ADN se separa de las perlas y transfiere a otro tubo, mientras que las

perlas continúan siendo retenidas por el magneto.

Es necesario saber que la mayoría de los kits tienden a ser generales a la hora de su aplicación, pero se

diseñan con un propósito específico. Por ejemplo, un kit para extraer ADN de sangre total, considera la

presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el proceso. Este método será más agresivo en comparación con

un kit diseñado para extraer ADN de células o tejidos animales. En los manuales proporcionados por el

fabricante se detallan, además de los pasos a seguir en cada caso, la cantidad de muestra recomendada y el
rendimiento esperado de acuerdo al tipo de tejido. Esta información debe tomarse en cuenta al momento de

elegir un kit. (Velázquez, Martínez, & Romero., 2004)

Dos etapas de técnicas de extracción de ADN.

Etapas de Técnica de
Extracción.

Separación de proteínas y lípidos. Unión selectiva del ADN a la matriz

inorgánica.

Dentro de esta técnica tratamos acerca

de obtención individual de proteínas y
lípidos, que muchas veces son necesario
para diferente toma de muestra.
Se la obtiene por medio de:
En esta técnica témenos una selección
minuciosa para obtener la matriz
orgánica de ADN, una parte que es
utilizada generalmente para la
cuantificación del ADN.

Se la obtiene por medio de:

Redisolución de ADN.
Unión selectiva del ADN a
Precipitación de proteínas y lípidos. la matriz inorgánica.
Recuperación del AND.

Para estas etapas de la técnica, es importante tener en cuenta, los

siguientes puntos para una mejor obtención:

✓ La colecta de la muestra.
✓ La homogeneización de tejidos y lisis celular.
✓ La cuantificación de ADN por espectrometría.
✓ Almacenamiento del ADN.

Homogeneización del tejido.

La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células para

facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético.
 La homogeneización mecánica incluye el uso de:

Nitrógeno líquido.

Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrógeno líquido, en un mortero de porcelana,

hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno líquido, congela de inmediato la muestra y evita que se formen

cristales en el interior, este procedimiento se puede utilizar en tejido fresco o congelado.

Es importante considerar que, si la muestra ya está congelada, se deberá disgregar con nitrógeno

líquido para evitar la degradación del ADN por acción de las DNasas.

Pistilos u homogeneizadores.

Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la pared del tubo que contiene la muestra,

adicionalmente se puede utilizar algún material abrasivo como vidrio pulverizado o resinas. El proceso se

realiza manualmente, con pistilos plásticos o con ayuda de dispositivos electrónicos, conocidos como

homogenizadores.

Es recomendable adicionar un poco del buffer de lisis antes de iniciar, estas soluciones desnaturalizan

a las proteínas y mantienen estable al ADN

No es recomendable utilizar este método con tejidos congelados, porque las células del interior del

tejido se descongelan antes de entrar en contacto con la solución de lisis y el ADN se fragmenta por acción de

las DNasas.

Homogeneizaciones químicas.

En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en solución a altas

temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicas que rompen las uniones entre las

células o que incluso pueden perforar la membrana celular.

 Antes de iniciar la homogeneización es necesario contar con información sobre la cantidad apropiada

de tejido que debe utilizarse pues una disgregación rápida y completa es esencial para asegurar la obtención de

ADN.

Por ejemplo:

*En el caso de tejido vegetal, el material liofilizado contiene mayor cantidad de células, por lo que se

recomienda utilizar solo el 50% de peso fresco.

*Si el tejido contiene una alta cantidad de polisacáridos o polifenoles, se inicia con el 25% del peso.

*Sin embargo, si la especie tiene un genoma pequeño es posible incrementar la cantidad hasta un 50%.

(Velázquez, Martínez, & Romero., 2004)

Conclusiones.

Se puede concluir de la práctica de laboratorio que se aprendió las diferentes formas de obtener el

ADN alguna utilizada en laboratorios para pruebas masivas y otras utilizadas para casos especiales o

específicos, de esta manera se entiende cuáles son algunos métodos utilizados para la observación del ADN

minuciosamente.

También se obtuvo información acerca de los procesos necesarios para la obtención del ADN y cuales

son los protocolos o medidas estrictas que se debe de tomar para cada método de obtención de ADN, también

se comprendió algunas etapas importantes dentro de la extracción del ADN, pues dentro de estas etapas es

necesario conocer acerca de purificación de ADN y condensación precisa del mismo, información importante

y relevante para los procesos de extracción.

Recomendaciones.

➢ Utilizar el método correcto para extraer el ADN exacto de la muestra solicitada.

➢ Cumplir con todos los protocolos para el cuidado y obtención pura del ADN.
 ➢ Identificar las etapas que se presentaran en la muestra del ADN específico.

➢ Saber en qué momento en apto utilizar los protocolos comerciales de extracción de ADN.

Bibliografía

Lizeth, J. (2019). Extraccion de ADN. Slidesshare.

Quezada, L. A. (2020). EVALUACIÓN DMÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN . Cuenca.
Rojas, A. C. (2020). Extracción de ADN. Conogasi.
Velázquez, L. P., Martínez, M. d., & Romero., A. C. (2004). Extracción y Purificación de ADN . Mexico.
Link del video explicativo: https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880

ELABORADO POR: REVISADO POR: VALIDADO POR:

Meyling Arlett Torres Torres. Meyling Arlett Torres Torres.