Ana Laura Padilla Camacho.

Laboratorio de biología molecular.

Fecha de entrega 01 de marzo, 2021.

PRACTICA No. 3

EXTRACCION DE DNA GENÓMICO A PARTIR DE SANGRE

PERIFERICA

INTRODUCCIÓN

El ácido desoxiribonucleico o DNA (DNA) es la molécula que guarda el código genético

de todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular,
eucarionte o procarionte, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.

Muchas de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del
material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el
conocimiento del código genético, que ya es posible clonar organismos enteros. Los
procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podían pasar varios días antes de saber
con certeza que se había logrado obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para
poder manipularlo. Además algunos de los reactivos usados para estos procesos son
tóxicos y mutagénicos. Hoy día podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en
unas horas y recientemente en pocos minutos.

Es importante señalar que que el DNA se encuentra localizado en el núcleo de las células
eucarióticas y por lo tanto solo puede ser obtenido de células nucleadas. Las células de
un organismo eucariótico multicelular no presentan diferencias de tamaño ni secuencia de
su DNA, las diferencias se presentan es a nivel de expresión genética, por lo tanto, si se
quiere conocer o estudiar el DNA de un individuo lo podemos hacer a partir de cualquiera
de sus células nucleadas. La sangre tiene un componente particulado compuesto por
células, en su mayoría son eritrocitos, los cuales durante su desarrollo pierden el núcleo.
Además de los eritrocitos en la sangre tenemos glóbulos blancos, células con núcleo y
que por lo tanto nos pueden servir para obtener DNA, entre otros grupos celulares.

OBJETIVO

Que el estudiante aprenda a extraer DNA a partir de muestras biológicas, utilizando la

sangre periférica como muestra.

MATERIALES Y REACTIVOS (Eliminar reactivos o materiales que no se

usen el la práctica virtual o en su caso, adicionar aquellos que sí se usen)

-Tubo Falcón de 15 mL
-Micro tubos de 1.5 mL
-Centrifuga para tubos Falcón de 15 mL
-Micro centrífuga
-Puntas amarillas y azules
 -Micro pipetas de 20, 200 y 1000 L
-Guantes de látex
-Tubos vacutainer con EDTA
-Jeringa de 5 mL
-Ligadura
-Sangre con anticoagulante (EDTA)
-Regulador de lisis TSNT (2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10 mM Tris-HCl
pH 8.0)
-Fenol saturado con Tris-HCl pH 8.0
-Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1v/v)
-Etanol absoluto y al 70%
-TE 1X (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)

PROTOCOLO

(Este protocolo es el normalmente usado; sin embargo, usted modifique

algunos de los puntos según la práctica virtual)

1. En un tubo de 15 mL colocar 3 mL de sangre con anticoagulante (EDTA).

Centrifugar a 3000 rpm por 5 min. Desechar sobrenadante y agregar a la pastilla 1
mL de TSNT (tritón 100X 2%; SDS 1%; NaCl 100mM; Tris-HCl pH 8.0 10mM),
mezclar por inversión.
2. Se adicionan 10 µL de RNAsa y se mezcla con cuidado. Posteriormente colocar la
muestra en el baño maría a 37°C de 30 minutos a 1 hora.
3. Colocar 10 µL de proteasa K y agitar un poco, con cuidado. Regresar la muestra al
baño maría ahora a 56°C de 30 minutos a 1 hora.
4. Adicionar 700 µL de Fenol- cloroformo isoamílico (25:24:1) y mezclar. Coloque la
muestra en la microcentrífuga a 13000 rpm por 10 minutos.
5. Separar la fase acuosa de la orgánica, colocando la fase acuosa en un tubo nuevo
y limpio.
6. Repita los pasos 4 y 5 a la fase acuosa que se obtenga después de la
centrifugación, al menos dos veces más, para obtener un DNA más puro.
7. Agregue 700 µL de cloroformo a la fase acuosa obtenida y mezcle con cuidado.
Posteriormente centrifugue a 13000 rpm por 10 minutos.
8. Separe la fase acuosa resultante en un tubo nuevo y limpio.
9. Repita los pasos 7 y 8 al menos dos veces más.
10. Agregue acetato de sodio 3M a la muestra (fase acuosa resultante).
Posteriormente agregue una solución de etanol al 95% a la muestra y agite un
poco. Después de esto, centrifugue a 13000 rpm por 30 minutos.
11. Agregue 700 µL de etanol al 70% y mezcle cuidadosamente. Después centrifugue
a 13000 rpm por 10 minutos.
12. Repita los pasos 10 y 11 al menos dos veces más.
13. Dejar secar la pastilla al aire y una vez seca resuspenderla en 10 µL de TE.

CONCLUSIÓN

Aprendimos a hacer la extracción de DNA mediante el uso de fenol- cloroformo-

alcohol isoamílico en proporciones 25:24:1. Se vio el manejo de los materiales, la
metodología para realizar dicha extracción y el cómo desechar los materiales
utilizados para manejar y contener el fenol.
CUESTIONARIO

1. Buscar en la literatura qué otros métodos están descritos para la extracción de

ácidos nucleicos a partir de muestras humanas.
Método calentamiento
Método del fenol- cloroformo
Método del acetato de potasio
Método del acetato potasio modificado
Método de bromuro de cetil-trimetil amonio

2. ¿De qué tipo de células sanguíneas espera obtener su muestra de DNA?

De los leucocitos, pues los eritrocitos no contienen núcleo.
3. ¿Usted extrae el DNA de 1000 células de hígado, suponiendo que la extracción
es al 100%, ¿considera que la cantidad de DNA que se obtenga será diferente de
la misma cantidad de células de bazo y de óvulos? Fundamente su respuesta.
Si, porque los óvulos tienen la mitad de la información genética.
4. En este protocolo, ¿por qué se usa fenol para la extracción, cuál es la función de
dicho reactivo?
El fenol es el componente orgánico, en este se disuelven las proteínas formando la
fase orgánica.
5. ¿Cuáles son las proteínas con las que interacciona el DNA nuclear?
Las histonas

BIBLIOGRAFÍA
1. Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition.
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001.